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广州医科大学的Tianfu Zhang等人基于热响应水凝胶研究近红外光触发的药物递送系统在协同光热治疗与化疗清除癌症干细胞的应用

2026-02-23 06:38:08

2024年

刺激响应型水凝胶增强光热疗法对抗癌症干细胞诱导的乳腺癌转移

-ACS Nano-

癌症干细胞 (CSCs) 的自我更新和分化特性导致了乳腺癌的化疗耐药性。尽管已开发出许多靶向CSCs的药物，但它们受到递送效率低和病灶部位积累不足的困扰。广州医科大学的Tianfu Zhang等人通过共包载具有聚集诱导发光 (AIE) 活性的光热剂和硫利达嗪 (THZ)，开发了一种热响应水凝胶，展示了一种由AIE剂触发的可控递送系统，以增强THZ介导的CSCs消融。在近红外激光刺激下，AIE剂产生的光热效应诱导水凝胶变形以实现药物的爆发式释放。水凝胶的精准原位肿瘤给药加速了药物在深部乳腺癌病灶中的扩散和积累。因此，THZ可以侵入肿瘤，并通过多巴胺受体阻滞和诱导氧化应激引发大规模CSC凋亡。结果表明，在乳腺癌小鼠模型中实现了有效的CSC抑制以及对肿瘤复发和转移的显著抑制。他们认为，这种基于智能水凝胶的递送系统代表了一种具有临床潜力的转移性乳腺癌治疗策略。

研究背景

乳腺癌的治疗仍然存在缺陷。目前的临床治疗依赖于手术切除辅助放疗和化疗。然而，由于癌症干细胞 (CSCs) 的存在，在最初成功的治疗后不可避免地会出现化疗耐药和放疗耐药，这使得肿瘤细胞极易复发和转移。乳腺癌患者的5年中位生存率仍然不容乐观。尽管发明了许多令人着迷的治疗方法，但单一疗法的有限有效性和系统性药物递送的低效率（仅旨在减少肿瘤体积），未能靶向肿瘤的心脏，即CSCs。

局部递送策略直接将药物给药至肿瘤部位，已被提议作为有前景的解决方案，通过避免长途递送和减少其他器官吸收药物产生的副作用，从而显著提高递送效率。迄今为止，刺激响应性水凝胶因其能够根据不同的肿瘤微环境变化（如温度、pH、光、离子强度和磁场）来调控水凝胶的流变行为而受到特别关注。其中，掺入光热剂的热敏水凝胶可以被入射的近红外 (NIR) 光触发并发生可逆的相变，显示出诸如深层组织穿透和高时空分辨率等优势。结合其固有的生物相容性、可调节的载药能力和可控的药物释放机制，这类水凝胶是用于终结CSCs的有前景的药物递送系统。

基于上述考虑，合成了一种聚集诱导发光体 (AIEgen) 并将其用作光热剂。它在近红外激光照射下聚集状态时产生热量，从而实现光热疗法 (PTT) 并作为基于水凝胶的药物释放系统的触发器。然而，仅靠PTT的治疗效果仍然不足以干扰CSCs顽强的细胞活性。最近的临床研究表明，接受多巴胺受体 (DR) 拮抗剂治疗的患者显示出癌症转移发生率降低，这是由于有效抑制了DR表达和CSC增殖。

在本研究中，作者巧妙设计了一种智能热响应联合药物递送系统，用于穿透性肿瘤内治疗。具体而言，工程化了一种纳米水凝胶，该水凝胶在光热效应下具有凝胶-溶液转变行为，用于负载AIE光热剂和硫利达嗪 (THZ)，命名为ATH。随着原位肿瘤积累，AIE光热剂在近红外激光照射下发挥温和PTT（约45℃）效应，这使得热响应水凝胶溶解，释放AIEgen和THZ以侵入肿瘤的更深部分。在药物可控释放进入癌细胞后，作为DR拮抗剂的THZ抑制DR表达并诱导氧化应激，导致PTT增强、高效的CSC凋亡和增殖抑制。结果，乳腺肿瘤抑制、对癌症转移和复发的有效抵抗得到了清楚的证实。此外，包囊的水凝胶复合材料引起的副作用可忽略不计，表明他们的热响应水凝胶系统在局部递送无法全身给药的药物方面具有广阔的潜力。

结果一、材料制备与表征

图 1 (a)热响应ATH凝胶制备的示意图。(b)纯琼脂糖水凝胶、THZ、AIE点和ATH凝胶的吸收光谱。(c)ATH凝胶的SEM图像，比例尺：200μm。插图显示了ATH的放大区域，比例尺：50μm。(d)ATH凝胶在不同温度下的储能模量(G')和损耗模量(G'')的流变学测量。(e)ATH凝胶的G'和G''的时间扫描曲线。(f)在808nm激光照射(0.5W/cm²) 下，不同AIE 点浓度的ATH凝胶的温度升高。(g)制备的ATH在NIR照射前后的红外热成像3D温度图。(h)NIR激光触发下THZ从ATH中的累积释放曲线，n=3。箭头代表3分钟NIR激光照射的开始点。(i)在字母模具中照射5分钟前后ATH水凝胶的数码照片。

首先通过纳米沉淀法将名2TT-oC26B 的AIE光热剂与DSPE-PEG偶联来合成AIE点。透射电子显微镜 (TEM) 图像显示AIE点呈现均匀的球形，平均直径约为 100nm。AIE点的大小在PBS溶液中保持一致长达7天，表明具有优异的胶体稳定性。随后，将AIE点与THZ混合到琼脂糖水凝胶中，以获得智能热响应水凝胶，该水凝胶在37℃下进一步固化形成ATH水凝胶。由于存在吸收NIR的AIE点，ATH显示出蓝色，并且凝胶在808nm照射5分钟后经历熔化转变（图1a）。如图1b所示，出现了两个特征峰，这可归因于AIE点和THZ的掺入。冷冻干燥后ATH的微观结构使用扫描电子显微镜 (SEM) 进行了研究，揭示了相互连接的多孔形态（图1c）。为了评估制备的水凝胶的热敏感性，在20至60℃的温度范围内测量了流变特性，如储能模量 (G') 和损耗模量 (G'')。温度扫描显示G'和G''均随温度从20升高到60℃而逐渐降低（图1d）。由于ATH良好的可逆性，当温度冷却下来时，两个模量都迅速恢复。连续阶跃应变测试证明了ATH水凝胶的高流变恢复性能。如图1e所示，在0.1%的低剪切应变下，G'高于G''。当振荡幅度增加到γ=100%时，G''和G'均急剧下降。由于水凝胶的坍塌，G''变得高于G'。一旦应变恢复到0.1%，G''和G'均能恢复到其初始值。不含药物的凝胶也表现出类似的性能。含有200μg/mL AIE点的ATH的温度在激光照射5分钟内从20℃升高到45℃（图1f），这使热响应ATH凝胶软化成溶液状态。红外图像进一步描绘了由于水凝胶中AIE成分引起的光热效应（图1g）。基于ATH的NIR光触发相变过程，药物释放动力学有望得到理想的控制。如图1h所示，在NIR激光照射下，ATH在90分钟内表现出硫利达嗪和AIE点的持续释放，总释放量分别约为75%和61%，显示了ATH的可控释放能力。相比之下，当他们使用非热响应水凝胶（透明质酸甲基丙烯酰）包囊药物时，未显示出可控释放特性。此外，他们发现制备的水凝胶在光照下可以发生快速熔化，在去除最初形状为“A”的模具后，它们可以在光照条件下迅速溶解到形状为“I”的新模具中，随后在相同条件下转变为形状“E”，这显示了出色的凝胶-溶胶-凝胶循环转变（图1i）。

结果二、体外细胞杀伤与抗CSC机制

图 2 (a)不同负载THZ浓度的ATH+L处理后的4T1细胞活力,n=3。(b)在不同条件下与各种制剂共培养的4T1细胞的活力,n=3。(c)蛋白质印迹分析调查HIF-1a、p-Nrf2、NQO1 和HO-1的表达水平。Actin用作内参。I:PBS+NIR,II:ATH,III:THZ,IV:AH+NIR和V:ATH+NIR。(d)各种制剂处理后4T1细胞中ROS水平的共聚焦成像。DCFH-DA用作ROS指示剂，DAPI用于染色细胞核，比例尺：10μm。(e)使用膜联蛋白V/PI测定法分析不同处理下肿瘤细胞凋亡的流式细胞术分析。统计显著性使用单因素方差分析(ANOVA)确定：***p<0.001。

图 3 (a)细胞提取后nCSCs和CSCs表面CD133的免疫荧光染色。比例尺：20μm。分别用不同浓度的(b)AIE点和(c)THZ处理的nCSCs和CSCs的活力。(d,e)各种处理下4T1 CSCs的成球测定和存活分数。比例尺100μm。(f)蛋白质印迹分析调查各种处理后 DR2表达、NFkB 通路和PI3K/Akt/mTOR 通路。Actin用作参考。I:PBS+NIR,II: ATH,III:THZ,IV:AH+NIR,和V: ATH+NIR。(g)ATH 通过靶向 PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/NFkB通路诱导CSC凋亡。数据显示为平均值±SD(n=3)。统计显著性使用单因素方差分析 (ANOVA) 确定：ns=无显著性, *p<0.05, ***p<0.001。

随后，详细探讨了ATH的抗肿瘤作用。仅包囊AIE点的水凝胶被设为对照组之一，命名为AH。首先，测试了ATH中不同浓度THZ的效果。4T1细胞的细胞活力随着硫利达嗪浓度的增加而急剧下降。当浓度达到20μg/mL时，几乎90%的癌细胞被杀死（图2a）。与游离THZ和NIR照射下的AH相比，NIR照射下的ATH处理导致更明显的细胞增殖抑制，证实了化疗-光热联合治疗的优越效果（图2b）。为了研究THZ诱导癌细胞死亡的潜在机制，评估了细胞活性氧 (ROS) 和与氧化应激相关的蛋白表达。根据蛋白质印迹 (WB) 分析，p-Nrf2（参与细胞氧化应激反应的关键转录因子）及其下游靶标HO-1、NQO1和HIF-1a的表达水平显著降低（图2c）。DCFH-DA探针用于检测细胞内ROS水平。如图2d所示，在NIR照射下，用ATH和NIR激光处理的细胞与游离THZ组和照射下的AH组相比显示出更强的绿色荧光，表明ROS产生增加。此外，使用膜联蛋白V/PI测定法，NIR照射下的ATH(ATH+NIR)诱导了显著的细胞凋亡，这与细胞毒性结果一致。RAW264.7细胞用于评估生物相容性。虽然分子药物THZ对RAW264.7细胞显示出活力降低，但在治疗过程中它被包囊在光热响应水凝胶ATH中，从而显著降低了其对正常细胞的细胞毒性，并确保在肿瘤部位的靶向释放。这与显示ATH无细胞毒性的实验结果一致。总的来说，优异的抗癌治疗效果可归因于AIE光热效应与THZ诱导的细胞氧化应激的结合，它们协同杀死了4T1癌细胞。

尽管已经报道多种用于根除癌细胞的治疗方法，但抑制癌症复发的有效性是有限的。CSCs是对传统疗法更具抵抗力的主要原因。THZ作为一种DR抑制剂，显示出通过诱导严重的氧化应激和凋亡来抑制CSC生长的潜力。受其对癌细胞的高效抑制作用的鼓舞，他们进一步研究了ATH的抗CSC潜力。CD133信号（红色荧光）表明CSCs被成功分选（图3a）。为了进一步证实THZ和AIE点对CSCs自我更新能力的影响，分别用不同浓度的这两种药物处理4T1 CSCs。如图3b所示200μg/mL的AIE点可以杀死52.4%的非癌症干细胞(nCSCs)。当用于治疗CSCs时效果较弱，在相同浓度下仅杀死31.3%的CSCs。THZ治疗对CSCs和nCSCs均显示出相当的治疗效果（图3c）。然而，其单一疗法对CSCs的作用有限。相比之下，如图3d,e所示，激光照射下的ATH 治疗使CSCs的肿瘤球体形成率最小化 (8.8%)，这远低于THZ治疗(27.5%)和AH+NIR治疗(41.1%)。结果表明ATH有效地杀死了CSCs并阻止它们形成球体。药物的细胞内释放对增强药物生物活性起着至关重要的作用。使用 LysoTracker Green探针通过共聚焦激光显微镜评估了ATH的细胞摄取。在10分钟内观察到红色荧光探针标记的AIE点与LysoTracker Green的绿色荧光的共定位，揭示了AIE点的溶酶体靶向能力。众所周知，溶酶体属于内膜系统，作为细胞的动态调节器，与细胞凋亡和坏死密切相关。AIE点的溶酶体靶向PTT效应将极大地增强THZ的精准治疗。进行了一系列WB分析以研究ATH系统的抗CSC机制。首先，多巴胺受体(DR2)蛋白含量在THZ和ATH+L组中显示下调表达，表明硫利达嗪充当DR阻滞剂以干扰多巴胺过表达的肿瘤微环境。接下来，作为下游信号成分的磷酸化PI3k、P-AKT和p-mTOR的表达在ATH+L治疗和THZ治疗后也显著下调。PTEN通路通常伴随着PI3K和AKT的负调节。与PBS、ATH和 AH+L 组相比，ATH+L和THZ治疗显著上调了PTEN。此外，与肿瘤生长相关的p-NFkB p65蛋白的表达在ATH+L和THZ治疗后也显著降低（图3f）。这些发现表明，硫利达嗪诱导的氧化应激和AIE点的光热效应通过同时破坏 PI3K/Akt/NFkB和PI3K/Akt/mTOR 通路，共同抑制了CSC增殖并诱导了CSC凋亡（图3g）。

结果三、体内治疗效果与抗转移评估

图 4 (a) 激光照射(1W/cm², 5min)后ATH抗肿瘤治疗的示意图。(b)指示治疗组中 808nm激光照射(1W/cm²)5分钟后肿瘤的IR热图像。(c)指示治疗组中植入4T1肿瘤的小鼠在808nm激光照射(1W/cm²)5分钟后的温度升高。(d)不同组中每只小鼠的肿瘤生长曲线。(e)指示治疗后的肿瘤图像。(f)指示治疗后的肿瘤重量。(g)指示治疗后的存活率。小鼠分为五组。I:PBS+NIR, II:ATH, III:THZ, IV：AH+NIR和V:ATH+NIR。数据显示为平均值 ±SD（n=5)。

图 5 不同处理后收集的肿瘤切片的DR2、DCFH-DA、TUNEL、Ki-67、CD133和H&E的免疫荧光染色。比例尺：20μm。

图 6 (a)ATH治疗后抑制肿瘤转移的示意图。(b)各种治疗后小鼠的收集肺（左)和肺组织的 H&E 染色（右)。比例尺：200μm。(c)每组肺转移结节的定量分析。数据显示为平均值 ±SD(n=5)。统计显著性使用单因素方差分析 (ANOVA)确定：**p<0.01, ***p<0.001。

为进一步评估NIR激光可激活ATH的治疗效果，根据五个组对4T1荷瘤小鼠进行瘤内注射不同制剂，每组包含5只小鼠：PBS、ATH、THZ、AH+NIR和ATH+NIR。AH+NIR和ATH+NIR组的小鼠用808nm激光以1W/cm² 照射5分钟。在治疗期间监测体重和肿瘤体积（图4a）。他们首先研究了体内激光触发的ATH离子热疗。红外热图像显示，与PBS处理(35.5℃)相比，注射ATH的小鼠在连续激光照射5分钟后温度升高至47℃（图4b,c）。AIE纳米颗粒优异的温和PTT可以触发有效的THZ释放（高于30℃）。为了评估药物动力学，进行了NIR荧光成像。用ATH和NIR照射治疗的小鼠显示出显著的肿瘤抑制。仅使用THZ或AH+NIR的单一疗法在最初的3天内也显示出肿瘤生长抑制。然而，肿瘤随后重新生长。这种复发可能源于THZ的耗尽以及在长期肿瘤生长过程中原位PTT的持续时间有限。同时，ATH或PBS治疗显示出指数级肿瘤生长（图4d）。光学肿瘤照片显示，ATH结合激光照射治疗导致肿瘤尺寸最小化，一些肿瘤完全消失，这与该治疗组最低的肿瘤重量一致（图4e,f）。ATH+NIR治疗的小鼠在60天时显示出延长的存活率(100%)，这显著长于PBS (38天)、ATH (45天)、THZ (44天)和AH+NIR (48天) 组。

接下来，对肿瘤组织的病理切片进行了苏木精和伊红 (H&E) 染色以及各种免疫组织化学分析。H&E染色描绘了ATH+NIR组大多数肿瘤细胞出现了组织病理学改变和坏死（图5）。TUNEL和Ki67染色说明了远隔肿瘤的破坏和癌细胞增殖的抑制。CD133染色代表了CSCs的活力。在ATH+NIR组中观察到CD133的荧光信号减弱，证明CSCs被有效杀死。此外，免疫荧光染色和WB测试共同证明了对DR2、PI3K/Akt/NFkB 和 PI3K/Akt/mTOR通路的抑制。因此，可以安全地提出ATH凝胶优异的体内外抗肿瘤和抗CSC能力的机制：首先，激光照射刺激来自AIEgen的光热效应，这溶解了水凝胶并原位释放了硫利达嗪。硫利达嗪作为多巴胺受体阻滞剂，通过同时抑制PI3K/Akt/NFkB和PI3K/Akt/mTOR 通路成功诱导了氧化应激和内质网应激，这增强了溶酶体靶向AIE点的PTT效应。这表明ATH显示出PTT和化疗的最佳协同效应，以实现高效的抗肿瘤行为和复发抑制。

相反，由于癌症干细胞的存在，乳腺癌极易产生耐药性并转移至肺部。受ATH水凝胶在抑制肿瘤复发和刺激抗肿瘤免疫反应方面优异表现的鼓舞，他们进一步评估了其对小鼠长期转移抑制的影响（图6a）。如图6b,c 所示，来自PBS+NIR组的肺组织显示出明显的肿瘤结节（白色箭头），而来自ATH+NIR组的肺组织保持健康，未发现任何转移结节。同样H&E染色证实ATH+NIR治疗有效抑制了肿瘤转移和复发。定量结节结果进一步验证了这些结果，证明了ATH水凝胶中AIE光热剂和硫利达嗪的持续和激光触发释放提供了对残留4T1肿瘤细胞向肺部迁移的长期预防。为了评估长期抗肿瘤免疫的效果，他们研究了肺转移模型中不同治疗小鼠收集的血液样本中记忆T细胞 (CD3+CD8+CD62L+CD44+)的频率。ATH+NIR组中记忆T细胞的比例显著增加，高于AH+NIR和THZ组中观察到的比例。这暗示ATH+NIR治疗产生的功能性记忆T细胞可能有益于刺激抗肿瘤免疫反应。为了评估治疗的生物安全性，对主要器官进行了苏木精和伊红(H&E)染色。在ATH+NIR治疗后，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中未观察到明显的病理异常或炎症细胞，这与PBS组一致。常规血液和生化测试显示ATH+NIR和PBS组之间没有显著差异。总的来说，生物相容性评估表明，他们的水凝胶纳米复合材料中的THZ和AIE点在光疗和化疗中不会引起全身不良反应。

结论与意义

近几十年来，由于许多先进的治疗方法，乳腺癌患者的情况已大大改善。然而，CSCs的存在导致了对传统疗法的抵抗，通常导致在最初成功的化疗和放疗后不可避免的肿瘤复发。THZ最近已成为一种靶向CSCs的有前景的药物，但在维持深层肿瘤积累方面面临挑战。为了克服THZ有限的药物递送效率，他们开发了一种可注射的NIR光响应纳米凝胶，以实现药物快速渗透到肿瘤中。该水凝胶系统名为ATH，包含THZ和AIE光热剂。在原位注射到肿瘤部位和NIR激光照射后AIE光热剂产生的热量加速了ATH变形，使药物释放和扩散以增强肿瘤积累。此外，来自AIE点的PTT增强了THZ的级联治疗效果，其中包括抑制DR2、PI3K/Akt/NFkB和PI3K/Akt/mTOR 通路。因此，他们的水凝胶复合物在体外和体内均实现了对4T1 CSCs的有效抑制，同时也有效地抑制了肺转移并延长了小鼠的存活率。因此，这种基于水凝胶的光热响应药物递送系统抑制了CSC的生长和转移，为改善乳腺癌患者的生活提供了见解。