研究背景

免疫检查点阻断（ICB）疗法在多种肿瘤治疗中展现出显著潜力，但其疗效在免疫学“冷”肿瘤中常受到限制，这类肿瘤因缺乏足够的T细胞浸润而难以被免疫系统识别和攻击。导致ICB疗效不佳的一个重要因素在于肿瘤细胞的代谢重编程，尤其是Warburg效应使得肿瘤细胞高度依赖有氧糖酵解，大量消耗葡萄糖并分泌过量乳酸，从而剥夺了效应T细胞所需的营养，同时营造出强烈的免疫抑制微环境。针对这一难题，研究者提出同时剥夺葡萄糖和乳酸的策略，以逆转代谢抑制并增强免疫应答。然而，现有酶类工具如葡萄糖氧化酶（GOx）和乳酸氧化酶（LOx）虽能分别催化葡萄糖和乳酸的消耗，但其催化活性高度依赖氧气，而肿瘤微环境固有的乏氧特性严重制约了其功能发挥，且催化过程中的氧耗会进一步加剧缺氧，成为限制该策略临床转化的核心瓶颈。

研究思路

为突破肿瘤乏氧对酶催化活性的限制，研究者设计了一种仿生纳米乳系统，将GOx和LOx与全氟三丙胺（FTPA）共包封于纳米乳核心内，并在表面覆盖表达PD-1的细胞膜。FTPA因其对氧气的高亲和力，可作为局部氧库为酶反应持续供氧，从而在乏氧肿瘤微环境中维持GOx和LOx的高效催化活性。同时，表面展示的PD-1蛋白不仅能够与肿瘤细胞表面的PD-L1结合以实现免疫检查点阻断，还能促进纳米乳被肿瘤细胞主动内吞，提高靶向递送效率。

基于此思路，研究者构建了FGL@PM纳米乳体系。透射电镜显示FGL呈球形，粒径约80 nm，表面包覆PD-1膜后粒径增至约143.5 nm，并可见明显的膜层厚度。Western blot证实PD-1蛋白仅在工程化细胞膜上表达，而普通HEK293T细胞膜无此蛋白。通过氧含量测定发现，FTPA的引入使纳米乳在氧合后氧含量显著升高，且FGL@PM在葡萄糖或乳酸存在下产生的H₂O₂量及pH变化均优于游离酶，表明FTPA供氧有效增强了GOx和LOx的催化效率，即使在乏氧条件下仍保持较高活性。

该体系的协同设计有效解决了酶催化与免疫检查点阻断联用的多重障碍。一方面，FGL@PM通过PD-1介导的靶向内吞富集于肿瘤细胞内部，GOx催化葡萄糖氧化生成H₂O₂并降低糖酵解通量，从而减少乳酸源头供应；另一方面，LOx直接消耗胞内已有乳酸并额外产生H₂O₂。双重酶反应不仅协同耗竭肿瘤细胞的关键能量底物，还通过产生的H₂O₂扰乱胞内氧化还原稳态，进而激活免疫原性细胞死亡信号，为后续抗肿瘤免疫应答的启动奠定基础。

图1 机制示意图

研究内容

研究完成 FGL、细胞膜囊泡 PM、终产物 FGL@PM 全套材料制备与系统表征。透射电镜观测可见 FGL 为球形纳米液滴，外层 PM 膜包覆后形成清晰 11 nm 薄膜结构；蛋白免疫印迹结果证实 PM 膜特异性表达 PD-1 蛋白，空白 HEK293T 细胞膜无对应条带；动态光散射检测显示 FGL@PM 水化粒径 143.5 nm，电位与细胞膜囊泡接近，具备良好生物界面相容性。酶负载率达到 8.4%，包封效率 83%，48 小时仅释放 11.6% 酶蛋白，载体可稳定包裹两种功能酶。充氧 3 分钟后 FGL@PM 体系溶氧浓度显著高于纯水与未负载 FTPA 对照组，在不同葡萄糖、乳酸浓度梯度下，FGL@PM 催化产生过氧化氢的能力远高于游离 GOx、游离 LOx，催化反应带来的 pH 下降幅度也更明显，证明 FTPA 供氧可大幅提升双酶催化性能。

图2 FGL@PM的特征描述

使用H₂DCFDA探针检测发现，FGL处理4T1细胞后胞内绿色荧光强度显著高于FG或FL单酶组，表明GOx与LOx协同催化产生大量H₂O₂。同时，细胞内葡萄糖和乳酸含量测定显示，FGL组葡萄糖水平与FG组相当，但乳酸水平较FL组进一步下降，证实GOx通过减少糖酵解底物间接降低了乳酸生成，而LOx则直接清除已有乳酸。代谢流分析表明，FGL处理12小时后，4T1细胞的氧消耗率和胞外酸化率均受到显著抑制，说明氧化磷酸化和糖酵解两条能量通路同时受损。

图3 体外GLCD策略

MTT实验表明，在常氧条件下FGL在200 ng/mL酶浓度时杀伤率达76.2%，显著高于FG和FL组；即使在1%氧浓度的乏氧环境中，FGL仍保持70.6%的杀伤率，验证了FTPA供氧对酶活性的保护作用。流式细胞术显示FGL处理组晚期凋亡细胞比例明显增加，同时胞内谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值显著降低，脂质过氧化水平升高，表明氧化还原平衡被严重破坏。转录组测序进一步揭示FGL诱导了1550个差异表达基因，富集于p53、TNF、凋亡和坏死性凋亡等通路，代谢组学则发现561种代谢物发生显著变化，涉及磷脂、氨基酸及谷胱甘肽代谢等，证实FGL从多层面重编程肿瘤细胞代谢并驱动细胞死亡。

图4 采用GLCD策略后4T1细胞mRNA的转录分析

图5 采用GLCD策略处理4T1细胞的非靶向代谢组学分析

近红外荧光活体成像验证 PD-1 细胞膜的肿瘤靶向功能，尾静脉注射 FGL@PM 后 2 小时肿瘤荧光信号达到峰值，离体脏器荧光定量证明 FGL@PM 肿瘤富集量显著高于无膜包覆的 FGL 组，证实膜表面 PD-1 介导主动靶向。光声成像用于实时监测瘤内氧气含量变化，尽管 GOx、LOx 催化会消耗氧气，但 FTPA 持续释氧可将肿瘤氧含量恢复至接近空白 PBS 组水平，有效缓解肿瘤缺氧，为酶持续催化提供基础条件。

图6 体内FL/PA影像

在单侧皮下4T1移植瘤模型中，分别给予PBS、GL、FGL或FGL@PM治疗（第1、3、5、7天静脉给药，GOx剂量为20 mg/kg）。结果显示FGL@PM组肿瘤生长被显著抑制，第18天肿瘤体积和重量均为最小。组织学分析表明，FGL@PM组肿瘤内Ki67增殖指数和HIF-1α表达水平明显降低，而TUNEL凋亡染色阳性细胞数最多，证实该策略在体内有效抑制肿瘤增殖、缓解缺氧并诱导大量细胞凋亡。

图7 单侧皮下4T1肿瘤携带小鼠模型中的体内治疗效果

双侧荷瘤模型免疫激活评价在模拟远端效应的双侧4T1模型中，原发灶切除后对侧肿瘤接受不同治疗，FGL@PM组对侧肿瘤生长同样受到明显抑制。流式细胞术显示，FGL@PM处理组肿瘤引流淋巴结中成熟树突状细胞（CD80⁺CD86⁺）比例显著上升，肿瘤组织内CD8⁺细胞毒性T细胞浸润增加，调节性T细胞（CD4⁺Foxp3⁺）比例下降。免疫荧光染色进一步证实FGL@PM组肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞密度明显高于其他对照组，说明GLCD策略有效逆转了免疫抑制微环境，激发了系统性抗肿瘤免疫应答。治疗期间各组小鼠体重无明显波动，主要脏器HE染色未见明显病理损伤，表明FGL@PM在治疗剂量下具有良好的生物相容性和低系统毒性。

图8 通过GLCD策略在双侧皮下4T1肿瘤携带小鼠模型中实现ICB的体内增强

总结

本研究针对免疫冷肿瘤治疗中缺氧限制代谢酶活性、葡萄糖乳酸双重代谢抑制、PD-L1 介导免疫逃逸三大核心障碍，开发 PD-1 基因工程细胞膜包覆携氧纳米乳液 FGL@PM。体系依靠 FTPA 持续供氧保障 GOx、LOx 高效同步清除瘤内葡萄糖与乳酸，膜表面 PD-1 蛋白同步实现肿瘤靶向递送与 PD-1/PD-L1 检查点阻断，葡萄糖乳酸协同耗竭产生大量过氧化氢，双重抑制肿瘤糖酵解与氧化磷酸化代谢，诱导肿瘤氧化损伤、凋亡坏死。体外细胞实验、转录代谢组学完整证实该体系的代谢重塑与细胞杀伤能力，活体成像验证肿瘤靶向富集与缺氧微环境改善；单侧、双侧远端荷瘤小鼠模型均证明 FGL@PM 可强效抑制原发与远端肿瘤生长，同时促进树突状细胞成熟、降低抑制性 Treg、提升细胞毒性 T 细胞肿瘤浸润，系统性重塑抗肿瘤免疫微环境。整套纳米体系无明显体内毒副作用，为代谢干预联合免疫检查点阻断疗法攻克免疫冷肿瘤提供了可转化的一体化仿生纳米平台。

全文链接

https://doi.org/10.1021/acsnano.5c19115