细菌纤维素（BC）作为一种由醋酸菌属等微生物合成的生物材料，凭借其极高的纯度、优异的生物相容性、突出的机械强度以及独特的三维纳米纤维网络结构，在生物医学、柔性电子、可降解复合材料等多个领域展现出广阔的应用前景。其无木质素和半纤维素的特性的赋予了它出色的孔隙率与保水性，然而，BC 自身缺乏抗菌、抗炎、抗氧化、细胞黏附等关键生物活性，这严重限制了它在先进生物医学尤其是慢性伤口愈合等场景中的应用。目前已有的 BC 功能化策略存在诸多局限：物理吸附法虽条件温和，但功能分子与 BC 间仅为弱非共价相互作用，易快速渗漏导致功效失效；化学接枝法虽结合更稳定，却往往需要强酸、有毒溶剂等苛刻条件激活 BC 的羟基，不仅可能破坏 BC 的结构完整性，还可能降低其生物相容性。近年来兴起的代谢糖工程虽为 BC 功能化提供了新思路，可通过向产纤维素细菌投喂修饰后的糖前体实现功能分子的原位整合，但该方法仍面临修饰单糖合成步骤繁琐、产率低，代谢屏障导致细菌生长或 BC 产量受抑，且不同功能衍生物需逐一验证兼容性等问题，难以实现高效、多样化的功能拓展。
针对 BC 功能化过程中 “保留固有优良性质” 与 “赋予多样生物活性” 难以兼顾的核心科学问题，研究团队开发了一种结合代谢糖工程与点击化学的生物正交功能化策略，为解决上述困境提供了创新性方案。该策略的核心原理分为两步：第一步是通过代谢糖工程实现叠氮基团的原位掺入，研究者合成了叠氮修饰的 N - 乙酰葡萄糖胺类似物（GlcNAz），将其与葡萄糖共同作为碳源投喂给 Komagataeibacter 属产纤维素细菌（包括 K. rhaeticus、K. xylinus 和 K. sucrofermentans），利用细菌自身的代谢系统，在 BC 生物合成过程中将叠氮基团均匀整合到纤维素网络中，形成叠氮修饰的 BC（GlcNAz-BC）。这一过程无需苛刻化学处理，且 GlcNAz 浓度在 2mM 以下时不会影响细菌生长与 BC 产量，解决了传统化学修饰的弊端。第二步是基于点击化学的特异性功能化，GlcNAz-BC 中的叠氮基团可在温和的水溶液条件下，通过铜催化的叠氮 - 炔烃环加成（CuAAC）或无铜的应变促进叠氮 - 炔烃环加成（SPAAC）反应，与带有炔基标签的各类功能分子实现高效、特异性共价结合。为解决蛋白质功能化时易失活的问题，团队采用了基于光氧化还原催化的甲硫氨酸位点选择性修饰技术，利用 BVSB 试剂在温和碱性条件下为蛋白质引入炔基，既保证了蛋白质的结构与生物活性，又实现了与 GlcNAz-BC 的稳定结合。针对慢性伤口愈合中高血糖和氧化应激两大关键障碍，研究团队进一步构建了葡萄糖氧化酶（GOx）与超氧化物歧化酶（SOD）双酶功能化 BC 敷料：GOx 可催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，降低伤口局部血糖水平；SOD 则能将伤口微环境中过量的超氧阴离子（O₂⁻）转化为氧气和过氧化氢，再进一步协同转化为无毒的水和氧气，有效清除活性氧（ROS），减轻氧化应激损伤，同时缓解伤口缺氧状态，形成协同治疗闭环。
为验证该策略的可行性与优越性，研究团队开展了系统的理化表征。通过 confocal 激光扫描显微镜（CLSM）对 GlcNAz-BC 进行荧光标记检测，发现其与炔基荧光探针（VA）反应后的荧光强度是对照组的近 5 倍，且比传统叠氮修饰剂 2 - 叠氮 - 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖（deO）修饰的 BC 高 4.61 倍，证明 GlcNAz 的代谢整合效率更优；分子建模显示，GlcNAz 中的叠氮基团距纤维素主链距离（7.43Å）大于 deO 修饰后的距离（4.11Å），空间位阻更小，更利于后续点击反应。浓度优化实验表明，1mM GlcNAz 即可实现叠氮基团的饱和掺入，且该浓度下 GlcNAz-BC 与未修饰 BC 在宏观外观上均为白色疏松多孔片状结构，扫描电子显微镜（SEM）显示前者平均孔径仅比后者小 0.1μm，推测是叠氮修饰增强了纳米纤维间的分子相互作用，但湿润状态下仍能保证功能分子的可及性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在 1540.6 cm⁻¹ 和 1647.7 cm⁻¹ 处出现酰氨基的 C=O 伸缩振动峰，直接证实了叠氮基团的成功整合。力学测试显示，GlcNAz-BC 的杨氏模量与原生 BC 相当，但疲劳应变提高了 120%，表明叠氮修饰增强了 BC 的氢键网络，提升了韧性；热重分析（TGA）、酶降解实验和细胞相容性检测（CCK-8 法）均显示，GlcNAz-BC 与未修饰 BC 在热稳定性、降解速率和细胞毒性方面无显著差异，细胞存活率接近 100%，证明该修饰策略未破坏 BC 的固有优良性质。此外，该代谢糖工程策略对 K. rhaeticus、K. xylinus 和 K. sucrofermentans 三种常见产纤维素细菌均适用，且均能实现高效的叠氮整合，展现出良好的普适性。
在细胞水平的生物学评价中，该功能化平台展现出多样化的应用潜力。抗菌功能方面，将炔基修饰的光杀菌卟啉（Zn-Epor-PS）通过 CuAAC 反应结合到 GlcNAz-BC 上制备的 Por-BC，在白光照射下对白色念珠菌（C. albicans）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出强效杀菌活性：30 分钟内可减少 90% 的白色念珠菌，10 分钟内对金黄色葡萄球菌的杀灭率超过 99%，SEM 观察到细菌细胞膜变形破裂，而对照组细菌结构完整。细胞黏附功能方面，通过 CuAAC 或 SPAAC 反应将 Pra-RGD 肽修饰到 GlcNAz-BC 上得到的 RGD-BC，显著促进了 L929 成纤维细胞的黏附与铺展：细胞铺展面积是未修饰 BC 的 6.5 倍，活细胞数量增加 12.8 倍，Phalloidin/DAPI 染色显示 RGD-BC 表面的细胞骨架发育良好，而对照组细胞仍呈圆形，黏附能力有限。蛋白功能化方面，经位点选择性修饰的荧光蛋白（mCherry）与 GlcNAz-BC 结合后，荧光强度是对照组的 46 倍；辣根过氧化物酶（HRP）功能化 BC（HRP-BC）的化学发光寿命超过 30 秒，远高于物理吸附 HRP 的 BC（约 3 秒），证明共价结合显著提升了蛋白的稳定性。针对慢性伤口治疗的双酶体系（GOx/SOD-BC）在细胞实验中表现出优异的协同功能：DPPH 自由基清除实验显示，SOD-BC 的抗氧化活性比未修饰 BC 和物理吸附 SOD 的 BC 高 30%；GOx/SOD-BC 能有效抑制脂多糖（LPS）诱导的 RAW264.7 细胞内 ROS 升高；葡萄糖消耗实验证实，GOx-BC 和 GOx/SOD-BC 均能高效消耗葡萄糖，且经点击化学固定的酶保留量达 3.20μg/mg BC，远高于物理吸附组。生物安全性评估显示，GOx/SOD-BC 的溶血率低于 5%，内毒素水平 < 0.1 EU/mL，符合 ISO 10993-1 生物材料安全标准，且对 L929 细胞无明显细胞毒性，细胞存活率与正常培养基组相当。
为进一步验证该功能化 BC 敷料的体内治疗效果，研究团队采用 db/db 糖尿病小鼠构建了 10mm 直径的全层皮肤缺损伤口模型，该模型因存在葡萄糖耐受异常、肥胖和伤口愈合延迟等特征，能很好地模拟人类糖尿病慢性伤口的病理状态。实验设置了未处理对照组、纱布组、未修饰 BC 组和 GOx/SOD-BC 组，连续观察 14 天的伤口愈合情况。结果显示，前 5 天对照组和纱布组伤口炎症明显、渗出物较多，而 BC 组和 GOx/SOD-BC 组伤口保持相对干燥，炎症反应显著减轻；第 7 天，GOx/SOD-BC 组未愈合伤口面积仅为 26.40%，远低于 BC 组（45.16%）、纱布组（74.19%）和对照组（83.91%）；至第 14 天，GOx/SOD-BC 组伤口闭合率高达 92.12%，显著优于 BC 组（77.05%）、纱布组（59.93%）和对照组（44.78%）。组织学分析显示，第 14 天 GOx/SOD-BC 组的伤口组织形成了连续均匀的上皮层，真皮结构排列整齐，出现大量新生血管、毛囊和皮脂腺，真皮厚度超过 189.3μm，显著高于其他各组；Masson 三色染色显示，该组伤口处的胶原纤维交织致密，胶原沉积率比对照组和纱布组高约 5%，而对照组和纱布组的胶原纤维排列紊乱，真皮结构不完整。免疫荧光检测表明，GOx/SOD-BC 组能有效下调炎症因子 TNF-α 和 IL-6 的表达，同时上调抗炎因子 IL-4 的水平，有效调节伤口炎症微环境；新生血管标志物 CD31 的表达分析显示，该组 CD31 阳性区域比对照组增加 29.25%，证实其能显著促进伤口新生血管形成。21 天的皮下植入实验进一步验证了材料的生物安全性：小鼠血液常规指标正常，心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等主要器官无明显病理异常，未出现明显炎症反应或组织损伤。
该研究通过代谢糖工程与点击化学的创新性结合，成功建立了一种模块化、普适性强的 BC 生物正交功能化平台，有效解决了传统 BC 功能化方法中结构破坏、生物相容性下降、功能单一等关键问题。该策略无需苛刻化学条件，既能完整保留 BC 的生物相容性、机械强度等固有优势，又能通过灵活选择炔基修饰的功能分子，实现抗菌、细胞黏附、酶催化等多样化生物活性的精准赋予，展现出强大的模块化拓展能力。针对糖尿病慢性伤口愈合的核心痛点，构建的 GOx/SOD 双酶功能化 BC 敷料，通过协同调节高血糖和氧化应激微环境，在动物实验中显著加速了伤口闭合，促进了组织再生与血管新生，为慢性伤口治疗提供了新的有效方案。此外，该平台对多种产纤维素细菌的普适性，以及在小分子、肽、蛋白质等不同尺度功能分子上的成功应用，为其在生物传感、生物催化、组织工程等更多领域的拓展奠定了基础。未来研究可进一步优化叠氮基团接枝率的定量检测方法，拓展功能分子库，开发更高效的链接剂系统，以推动该功能化 BC 材料在临床转化与多领域应用中的突破。
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https://doi.org/10.1038/s41467-026-69130-8
