副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus,VP）是一种常见的食源性致病菌，易引起急性肠胃炎甚至败血症。该菌广泛存在于各地的河口和海洋中，通常因食用未煮熟的海产品或被交叉污染的食品而引发感染，其危害不容忽视。副溶血性弧菌的主要毒力因子包括不耐热溶血素（thermolabilehemoly⁃sin,TLH）、直接耐热溶血素（thermostabledirecthe⁃molysin,TDH）和TDH相关溶血素（TDHrelatedhe⁃molysin,TRH），分别由tlh、tdh和trh基因编码。往年我国副溶血性弧菌流行主要以O3:K6血清型为主，近几年，O10:K4作为新出现的血清型，在我国各地的食源性暴发事件中被频繁检出，逐渐成为优势血清型。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）通过对细菌全基因组进行酶切，产物经电泳分型鉴定，广泛用于食源性致病菌的溯源研究。全基因组测序（WGS）技术能提供细菌基因组的完整信息。近年来，随着WGS技术的不断成熟，其在细菌分型和溯源中的作用和优势日益突出。本研究收集深圳市罗湖区2020—2023年从食物中毒事件和感染性腹泻监测人群中分离的副溶血性弧菌，对其血清型、毒力基因和耐药特征进行分析，结合PFGE技术和WGS技术分析其分子流行特征，为副溶血性弧菌的防控和耐药性研究提供基础数据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
本研究所用的23株副溶血性弧菌分离自罗湖区食物中毒样本和辖区哨点医院腹泻监测患者的粪便样本。菌株的分离培养参考WS271—2007《感染性腹泻诊断标准》，生化鉴定通过使用全自动细菌鉴定及药敏分析系统vitek-2compact进行。
1.1.2 仪器和试剂
全自动细菌鉴定及药敏分析系统vitek-2com⁃pact（法国生物梅里埃公司）；脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）；荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司）；3%NaCl碱性蛋白胨水、3%NaCl胰蛋白胨大豆琼脂培养基、M-H琼脂培养基（广东环凯生物科技有限公司）；弧菌显色培养基（法国科玛嘉公司）；生化鉴定试剂VITEK2GN板（法国生物梅里埃公司）；肠炎弧菌型别免疫血清（日本生物科学研究所）；副溶血性弧菌TDH、TRH双重核酸检测试剂盒（深圳生科原生物有限公司）；限制性内切酶SfiⅠ和XbaⅠ（纽英伦生物技术有限公司）；药敏纸片（北京天坛药物生物技术有限公司）；全基因组DNA提取试剂盒（普洛麦格生物技术有限公司）。
1.2 研究内容和方法
1.2.1 血清分型、毒力基因检测和药敏试验
参照《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7—2013），采用玻片凝集法对副溶血性弧菌进行血清分型，以生理盐水为对照。采用实时荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh。采用K-B纸片扩散法检测副溶血性弧菌对12种抗菌药物的敏感性（氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、美洛培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、四环素、氯霉素和磺胺甲噁唑）。大肠埃希杆菌ATCC25922作为质控菌。根据文献判断药敏结果。
1.2.2 PFGE分析
菌株复苏后，参照致病菌识别网PFGE标准化操作程序进行实验。采用限制性内切酶SfiⅠ对副溶血性弧菌50℃酶切4h，以XbaⅠ对沙门氏标准菌株（H9812)37℃酶切2.5h作质控；酶切产物经电泳分型鉴定（电泳温度14℃，起始转换时间为10s，终止转换时间为35.03s，电泳时间为19h）。将所得的电泳图谱上传至国家致病菌识别网进行比对分析并输出亲缘关系图谱。
1.2.3 WGS分析
采用细菌DNA提取试剂盒提取副溶血性弧菌的基因组DNA，委托广东美格基因科技有限公司进行全基因组测序，序列经denovo拼接组装后，用于后续生物信息学分析。基于WGS得到的数据，以VpRIMD2210633基因组为参考序列，运用Snippyv4.6.0软件，分析核心基因组单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs），并用snp-dist(https：//github.com/tseemann/snp—dists）输出菌株之间的SNP距离矩阵。采用FastTree软件构建SNP系统发育树，并将生成的进化树使用Fig⁃tree进行注释和可视化。将菌株基因组序列上传至多位点序列分型（multilocussequenceanalysis,MLST）在线数据库（https：//pubmlst.org/organisms/vibrio-parahaemolyticus）获取菌株的7个管家基因（recA,dnaE,gyrB,dtdS,pntA,pyrC,tnaA）的等位基因编号，根据等位基因编号得出菌株ST型。采用在线软件ResFinder4.6.0(https：//cge.food.dtu.dk/ser⁃vices/ResFinder/）进行耐药基因预测。本研究23株副溶血性弧菌基因组NCBI数据库序列号为SAMN48980001～SAMN48980023。
2 结果
2.1 副溶血性弧菌检出情况和血清分型及毒力基因检测结果
2020—2023年深圳罗湖区共发生8起细菌性食物中毒事件，其中由副溶血性弧菌引起的事件共有4起，共分离鉴定出副溶血性弧菌15株，均为患者分离株。血清分型结果显示：除事件1菌株vp402血清型为O4:KUT外，其余均为O10:K4(93.33%）。2020年1月—2023年12月辖区哨点医院共采集感染性腹泻患者粪便样本1659份，分离鉴定出副溶血性弧菌8株（2.63%），其中，血清型O10:K4、O3:K6、O4:KUT、O4:K42分别占比50.00%(4/8）、25.00%(2/8）、12.50%(1/8）、12.50%(1/8）。毒力基因检测结果显示：除菌株vp399不携带tdh和trh基因外，其余菌株毒力基因型均为tdh+、trh-(95.65%,22/23）。
2.2 药敏试验结果
对8类12种药物敏感性试验结果显示：本研究23株副溶血性弧菌除18株（78.26%）对氨苄西林中度敏感外，所有菌株对其余11种药物，包括氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、美洛培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、四环素、氯霉素和磺胺甲噁唑均敏感（均100.00%）。
2.3 PFGE分析
23株副溶血性弧菌经酶切电泳后，共获得了22个有效条带，菌株vp468因条带降解无法分型。按照相似度>85%的标准,22株菌共产生了5种PFGE带型，18株O10:K4型分离株聚类为同一群，相似度为100%；其余4株带型间的相似度为39.86%～82.86%，均小于85.00%，分属为4个不同PFGE型别。
2.4 WGS分析
系统发育树和SNP距离结果显示：18株O10:K4型副溶血性弧菌聚为一支，其SNPs差异数介于0～33。其中，食物中毒事件1、2、3和4分离的14株O10:K4型副溶血性弧菌SNPs差异数分别为0、0～1、0和0；腹泻监测分离的4株O10:K4型副溶血性弧菌SNPs差异数为6～33。2株血清型为O4:KUT的vp402和vp475聚为一支，其SNPs差异数为22。2株血清型为O3:K6的vp468、vp497和参考序列（RIMD2210633）聚集在一起，其SNPs差异数为98～353。血清型为O4:K42的vp399与其他22株菌遗传距离较远，其SNPs差异数为57540～59648。菌株MLST分型和耐药基因预测结果显示：18株O10:K4型和2株O3:K6型副溶血性弧菌均为ST3型，携带β-内酰胺酶类耐药基因blaCARB22；血清型为O4:KUT的vp402和vp475为ST2516型，携带β-内酰胺酶类耐药基因blaCARB20；血清型为O4:K42的vp399为ST2259型，携带β-内酰胺酶类耐药基因blaCARB33。
3 讨论
副溶血性弧菌是我国最重要的食源性致病菌之一，广泛存在于海产品中。深圳作为沿海城市，加强对副溶血性弧菌的监测和防控尤为关键。自2020年以来，O10:K4型副溶血性弧菌在全国各地感染性事件中被频繁检出，成为优势血清型。本研究从深圳市罗湖区2020—2023年食物中毒腹泻患者和感染性腹泻监测人群中分离到23株副溶血性弧菌，O10:K4占比78.26%(18/23），与广州、北京、湖州、广西等地的流行趋势一致。研究表明，新的血清型O10:K4与O3:K6具有高度相似的遗传骨架，携带大流行株特征基因tdh、orf8和toxRS/new。提示O10:K4型副溶血性弧菌有可能成为新的大流行株，有必要加强对其监测和病原学特征研究。研究表明，tlh毒力基因普遍存在于副溶血性弧菌中，是其特异性毒力基因，常用于副溶血性弧菌的鉴定，tdh和trh与副溶血性弧菌导致人类食源性疾病的暴发密切相关。食品来源的分离株很少携带tdh或trh毒力基因，而临床分离株携带率较高。本研究中，23株患者来源的副溶血性弧菌tdh毒力基因携带率为95.65%，与之前的研究结果一致。另外，有1株O4:K42型副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因均为阴性，Huang等也从腹泻患者中分离出9株tdh-trh-副溶血性弧菌，这提示即使从食品中分离到的副溶血性弧菌不携带tdh或trh毒力基因，也存在致病的可能，疾控和其他相关部门应加强水产品等食品中副溶血性弧菌的监测，预防食源性疾病的暴发。
随着抗生素在临床治疗、水产养殖和农业等领域的不当使用，细菌耐药性问题正变得日益严峻。研究显示，近几十年来，副溶血性弧菌的耐药基因数量明显增加。本研究基于WGS预测的耐药基因分析显示，所有分离株仅携带β-内酰胺酶类耐药基因blaCARB，与张志敏等和孔令汉等的研究结果相一致。药敏试验结果显示23株副溶血性弧菌除18株对氨苄西林中度敏感外，对其他11种药物均敏感，这与北京市昌平区和秦皇岛市报道的耐药情况稍有不同，而与孔令汉等的报道一致。尽管本研究未发现耐药菌株，但仍然需要持续监测，以预防多重耐药副溶血性弧菌的出现。
近年来，WGS已广泛应用于食源性疾病的溯源分析。基于WGS的SNP分析是一种新的分子分型方法，可以比较不同样本之间的单核苷酸变异，与传统的分型方法相比，具有更高的分辨率。本研究中，食物中毒事件2、3和4分离的12株副溶血性弧菌SNPs差异数分别为0～1、0和0，以SNPs≤6作为判断副溶血性弧菌食源性疾病暴发的依据，可以判定食物中毒事件2、3和4均由单一克隆引起。事件1分离的3株副溶血性弧菌SNPs差异数为0～58731，表明事件1由不同克隆引起，与血清分型结果一致（vp400和vp401为O10:K4,vp402为O4:KUT）。通过PFGE和SNP分析结果都可以判定事件2、3和4均由单一克隆引起。但值得注意的是，PFGE结果显示这3起事件的所有分离株带型一致，相似度为100%，然而，SNP分析结果表明事件3的分离株与其它2起事件的分离株为不同克隆，其SNPs差异数介于11～15，这一结果表明，在进行食源性疾病溯源调查时，基于WGS的SNP分析相较于PFGE具有更高的精确度。
综上所述，2020—2023年深圳市罗湖区腹泻病例中分离出的副溶血性弧菌主要血清型为O10:K4，与其他地区流行趋势一致。本研究表明PFGE和WGS技术都能很好地应用于副溶血性弧菌的分型研究。
然而，相较于PFGE，基于WGS的分型技术具有更高的分辨率，能够实现更精确的溯源。随着测序技术的不断成熟与成本的降低，WGS技术在基层医疗卫生机构的应用前景将更加广阔。
