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IF18.70!顶刊速递!中科院深圳先进院重磅斩获1 区成果,肠道噬菌体 Acr 蛋白成 CRISPR 免疫逃逸 “关键玩家”!

2026-04-16 05:09:59

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引言

❓为什么人类肠道噬菌体能高效逃避细菌 II 型 CRISPR 免疫？

❗中科院深圳先进院团队在《Cell Host & Microbe》发表研究，依托 UHGG 与肠道病毒数据库，通过生物信息学筛选、高通量功能验证及结构建模，解析出噬菌体编码抗 CRISPR（Acr）蛋白的逃逸机制，明确GutAcraca家族结构收敛、双重功能的核心作用，为相关生物技术开发提供关键依据。

💡研究发现 II 型 CRISPR-Cas 系统主导人体肠道，鉴定出 651 个噬菌体 Acr 候选蛋白，其中GutAcraca家族 213 个成员分布于 26% 肠道物种，兼具 CRISPR 抑制与转录自调控功能，且在温和噬菌体中高度富集，不同亚型还通过靶向 Cas9 不同域实现差异化抑制。

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亮点

🌏发现II 型 CRISPR-Cas 系统为人体肠道主导型，颠覆此前 I 型占优的认知；
📌高通量鉴定出651 个靶向 II 型系统的噬菌体 Acr 候选蛋白，36 个经验证有抑制活性，部分具泛抑制能力；
🔍找到首个实验验证的 II-B 亚型高效抑制因子AcrIIB-1，抑制效果显著；
✨发现全新GutAcrₐcₐ家族，213 个成员序列异质但结构收敛，兼具 CRISPR 抑制与转录自调控双功能；
🔑鉴定出目前已知最小的 Acr 分子（GutAcrₐcₐ-747 的 C 端 28 肽段）；
🔔GutAcrₐcₐ家族分布广泛（覆盖 26% 肠道物种），且 82.6% 富集于温和噬菌体，适配肠道生态；
📢解析出 Acr 蛋白多样化抑制机制，各亚型通过靶向 Cas9 不同域 / 干扰复合物形成实现逃逸；
📍建立一套高效的肠道 Acr 蛋白筛选与验证体系，为微生物组中 Acr 挖掘提供通用方法。

文献解读

研究背景

肠道菌与噬菌体存在共进化军备竞赛，细菌靠 CRISPR-Cas 抗噬菌体，噬菌体进化出 Acr 蛋白反制，但肠道噬菌体 Acr 蛋白的特征、机制仍缺乏系统解析；肠道微生态复杂、温和噬菌体占主导，现有技术难以实现肠道 Acr 的大规模挖掘与验证，相关研究仍是未开发领域。

研究目的

本研究旨在克服肠道噬菌体 Acr 蛋白挖掘的技术与生态相关挑战，通过整合生物信息学和高通量功能筛选方法，系统探究人类肠道噬菌体编码的抗 CRISPR（Acr）蛋白的多样性，解析其靶向肠道主导的 II 型 CRISPR-Cas 系统的抑制机制，挖掘新型 Acr 蛋白家族及功能特征，揭示肠道噬菌体与细菌的共进化规律，同时为新型生物技术工具开发和肠道微生态调控提供理论与实验依据。

研究方法

研究方法

数据挖掘与筛选：整合 UHGG 和 GVD 数据库，通过 CRISPR 间隔区匹配筛选互作噬菌体，结合 Prodigal 注释和 BLAST 分析，挖掘 Aca 同源物及相邻 ORF 作为 Acr 候选蛋白。

文库构建与高通量筛选：选取非冗余 Acr 候选基因，设计合成寡核苷酸文库，经重叠 PCR 组装后克隆至质粒，转化至表达不同 Cas9 ortholog 的大肠杆菌菌株，通过多轮串行转移筛选富集功能性 Acr。

功能验证：采用质粒干扰 assay 验证单克隆 Acr 活性，通过噬菌体噬斑 assay 确认 36 个代表性候选蛋白的 CRISPR 抑制功能。

机制解析：利用 AlphaFold3 进行蛋白结构及复合物建模，通过体外 DNA 切割实验，探究 Acr 对 Cas9 的抑制方式、剂量效应及孵育顺序依赖性。

结构与进化分析：基于 TM-score 进行结构相似性聚类，结合系统发育分析，揭示 Acr 家族的结构收敛特征与序列多样性；通过 BACPHLIP 预测噬菌体生活史，分析 Acr 分布与肠道物种的关联性。

转录调控验证：构建启动子 - 报告基因系统，通过诱导表达实验，检测 Acr 蛋白的转录自调控及交叉调控功能。

研究结果

肠道 CRISPR-Cas 系统分布特征

分析 286,997 个人类肠道细菌基因组，发现 II 型 CRISPR-Cas 系统占所有 CRISPR 系统的 47%（55,368 个），为肠道主导型，打破此前 I 型占优的认知；其在梭菌纲（58%）、拟杆菌纲（23%）和芽孢杆菌纲（12%）中富集，且 Cas9 蛋白呈现显著的门水平多样性，II-A 和 II-C 亚型主要分布于厚壁菌门，II-B 亚型仅存在于变形菌门。

图1.人类肠道中 CRISPR-Cas 系统的多样性与分布特征

Acr 候选蛋白高通量筛选结果

通过 CRISPR 间隔区匹配 33,242 个噬菌体基因组，筛选出 13,493 个 Acr 候选蛋白，构建 3,411 个非冗余基因库；经多轮串行转移筛选，富集得到 651 个靶向 6 种 Cas9 亚型的阳性 Acr 候选蛋白，其中 46% 可抑制≥2 种 CRISPR 系统，34 个具备泛抑制能力；阳性对照 AcrIIA5 富集倍数最高达 125 倍，阴性对照 GFP 则显著 depletion（斜率 < 0），验证了筛选体系的有效性。

图2.靶向 II 型 CRISPR-Cas 系统的抗 CRISPR 蛋白的生物信息学分析与功能筛选

Acr 蛋白功能验证结果

质粒干扰实验显示，6 种 Cas9 亚型对应的活性 Acr 克隆占比 51%-93%；36 个代表性候选蛋白经噬斑实验确认可有效保护噬菌体侵染（恢复 1-3 个数量级的噬菌斑滴度）；8 个广谱性 Acr 对 II-A 亚型（SpyCas9、St1Cas9 等）表现出强效抑制活性。

图3.抗 CRISPR 蛋白对 II 型 CRISPR 系统抑制活性的功能验证

Acr 蛋白机制解析结果

SpyAcr-357 在 10:1（Acr:Cas9） molar 比下抑制 SpyCas9，结合于 HNH 与 REC1/2 结构域之间的 DNA 沟槽，阻断 PAM 识别；FnAcr-3269（重命名 AcrIIB-1）为首个经验证的 II-B 亚型高效抑制剂，以 DNA 模拟机制结合 FnCas9 的 WED-PI 结构域，10:1 molar 比下近乎完全阻断其活性。

图4.肠道抗 CRISPR 蛋白的作用机制分析

GutAcrₐcₐ家族结构与分布特征

213 个 Acr 候选蛋白形成结构收敛簇（TM-score≥0.5），即 GutAcrₐcₐ家族，序列异质但折叠保守（RMSD=1.2±0.5），且 82.6% 富集于温和噬菌体；该家族成员多为小分子蛋白（<70 aa），在 26% 的肠道物种中广泛分布，覆盖厚壁菌门、变形菌门等主要菌群。

图5.GutAcraca蛋白的结构收敛性与功能表征

GutAcrₐcₐ家族双重功能验证

该家族兼具转录自调控与 CRISPR 抑制功能，N 端 HTH 结构域介导启动子 repression（如 P747 启动子被 GutAcrₐcₐ-747 抑制 10 倍），C 端结构域负责 CRISPR 抑制；不同成员机制存在差异，GutAcrₐcₐ-747 靶向 Cas9 的 PI 结构域，-4292 和 - 2778 则结合 sgRNA 阻断 RNP 复合物形成；其 C 端 28 个氨基酸肽段（747C28）为目前已知最小功能性 Acr 分子。

图6.GutAcraca蛋白的作用机制分析

小结

本研究通过多技术手段解析肠道噬菌体 Acr 蛋白，明确 II 型 CRISPR-Cas 系统为肠道主导型，鉴定出 651 个靶向该系统的 Acr 候选蛋白（36 个经验证有活性）；发现首个 II-B 亚型抑制剂 AcrIIB-1，以及兼具双功能、分布广泛的全新 GutAcrₐcₐ家族，还找到已知最小的功能性 Acr 分子，同时解析了 Acr 多样化抑制机制，建立的筛选体系也为相关研究提供了通用方法。