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深圳先进院阮长顺《Nat. Commun.》GLN 水凝胶空心支架 + 机械辅助后打印策略:4 秒快速载细胞,攻克难治性骨缺损

2026-05-21 05:27:55

核心速览

通讯作者及单位

阮长顺：中国深圳，中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与生物技术研究所，人体组织与器官退变研究中心；中国深圳，中国科学院生物医学成像科学与系统重点实验室

核心数据与结果

核心材料与参数

材料体系：GLN 复合水凝胶（12% 明胶甲基丙烯酰 + 10% Laponite 纳米粘土 + 12% N - 丙烯酰甘氨酰胺），压缩模量 989±49 kPa，压缩强度 1200±78 kPa；空心支架（HHS）内外径、网格间距可调（内径 0-0.6 mm，外径 0.4-0.8 mm），孔隙率适配细胞负载；

关键性能

机械响应快速，4 秒完成一次压缩 - 恢复循环，细胞负载量较静态提升 13 倍；可分区负载两种细胞（间充质干细胞 + 内皮细胞），细胞存活率 > 90%，无明显 ROS 升高；大鼠临界尺寸节段性骨缺损 12 周骨体积（BV）较纯支架组提升 2.1-2.5 倍，骨质疏松性骨缺损 8 周骨体积分数（BV/TV）显著高于空白组（p<0.0001）；

实验条件

细胞培养环境 37℃、5% CO₂；支架载细胞应变 80%，循环次数 1-10 次；动物实验为 12 周龄 SD 大鼠（节段性缺损）、3 月龄 SD 大鼠（骨质疏松模型），缺损直径 3-5 mm，术后 4、6、8、12 周检测。

关键功能结果

机制

类似 “心脏收缩舒张 + 海绵吸水”——HHS 支架借机械压缩 - 恢复产生内外压差，快速吸入细胞悬液，空心结构（V₁）和网格空间（V₂）分别负载不同细胞，GLN 水凝胶提供力学支撑和生物活性（含 Mg、Si 离子）；

核心发现

首次实现机械辅助生物打印后快速载细胞，解决传统生物打印细胞损伤、负载不均问题，HHS 支架抗疲劳（10⁴次循环完好）、载细胞友好，可修复两种难治性骨缺损；

优势

载细胞快速（4 秒）、均匀、精准；细胞损伤小；支持多细胞分区负载；支架力学稳定、可规模化制备；体内修复效果显著；

应用潜力

适用于大尺寸节段性骨缺损、骨质疏松性骨缺损等临床难治病例，为组织工程提供通用型细胞负载策略。

研究背景

大尺寸节段性、骨质疏松性等难治性骨缺损的临床修复仍是难题，核心瓶颈是缺损区细胞迁移不足或再生能力弱。传统 3D 生物打印虽能定制细胞负载结构，但挤压过程易造成细胞损伤，且水凝胶支架力学稳定性差。本研究基于 GLN 复合水凝胶，通过一步同轴打印制备心脏启发式空心水凝胶支架（HHS），开发机械辅助生物打印后策略，利用支架力学响应快速、均匀、低损伤载细胞，同步解决支架力学支撑和细胞高效负载问题，为难治性骨缺损修复提供新方案。

技术实验

一、HHS 支架的制备与可调结构

制备方法：采用一步同轴打印技术，无需支撑材料，GLN 水凝胶墨水经 UV 交联固化，直接形成空心结构，可打印骨形等复杂大尺寸支架（最大高度 6 cm）；

结构可调：支架空心丝内外径（d=0-0.6 mm，D=0.4-0.8 mm）、网格间距（L=0.2-0.8 mm）可通过模具和同轴喷嘴尺寸调控，空心空间（V₁）和网格空间（V₂）为细胞负载提供空间（图 1、图 2）；

图 1 | 大尺寸复杂 HHS 支架的制备：（a）机械辅助生物打印后策略示意图及其在临界尺寸节段性和骨质疏松性骨缺损修复中的应用；（b）具有高形状保真度的大尺寸骨形 HHS 支架照片；（c）悬浮在水中的 HHS 支架照片，可清晰观察到空心通道。

图 2 | HHS 支架的可调空心结构和网格：（a）HHS 支架关键参数示意图；（b）HHS 支架丝材和网格的宏观形态；（c）HHS 支架空心结构的荧光图像；（d）不同参数组合 HHS 支架的定量分析。

二、HHS 支架的优异力学性能

压缩与回弹：HHS 支架（L₀.₄D₀.₆d₀.₃/₀.₄）可承受 80% 应变不破裂，移除压力后 1 秒内快速恢复原状，类似心脏舒张收缩；

抗疲劳性：40% 应变下循环 10⁴次后仍完好，滞后面积无显著下降，归因于 GLN 水凝胶中可逆牺牲键（静电作用、氢键）的能量耗散（图 3）；

图 3 | HHS 支架（L₀.₄D₀.₆d_z）的力学性能：（a）HHS 支架的压缩测试；（b）HHS 支架吸收发光液体的过程照片；（c）HHS 支架的循环应力 - 应变曲线；（d）40% 应变下不同循环次数后 HHS 支架的宏观形态和空心结构；（e）HHS 支架抗疲劳机制示意图。

三、HHS 支架的机械响应性

溶液吸收：静态下依赖网格空间（V₂）吸水，动态压缩下空心空间（V₁）参与吸水，80% 应变时 V₁可完全充满溶液；

可视化验证：荧光微球实验显示，支架荧光强度随应变（20%-80%）和循环次数增加而升高，证实机械响应性可调控（图 4）；

图 4 | HHS 支架的机械响应性：（a-c）静态条件下不同参数 HHS 支架的吸水率；（d-f）动态压缩条件下不同参数 HHS 支架的吸水率；（g-i）IVIS 系统获取的 HHS 支架负载荧光微球的荧光图像和定量分析。

四、快速、精准的细胞负载能力

单种细胞负载：80% 应变下 4 秒压缩 - 恢复循环，人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）负载量较静态提升 13 倍，3 天培养后细胞均匀增殖，线粒体膜电位正常，ROS 无升高；

多细胞分区负载：利用 V₁和 V₂的机械响应差异，分别负载人脐静脉内皮细胞（HUVECs-RFP）和 hBMSCs-GFP，分区分布明确，HUVECs 可形成细胞连接，hBMSCs 成骨诱导 21 天出现钙沉积（图 5）；

图 5 | 机械响应性介导的 HHS 支架细胞负载：（a-b）静态和动态条件下 HHS 支架的细胞负载荧光图像和定量分析；（c-d）不同应变和循环次数对细胞负载的影响；（e）V₂机械响应介导的细胞均匀负载；（f）V₁+V₂机械响应介导的多细胞分区负载；（g）HUVECs 在 HHS 支架中的蛋白表达；（h）hBMSCs 在 HHS 支架中的茜素红 S 染色。

五、体内难治性骨缺损修复效果

节段性骨缺损：大鼠股骨 5 mm 临界缺损，HHS-M（负载大鼠 BMSCs）和 HHS-ME（负载大鼠 BMSCs + 内皮细胞）组 12 周实现完全桥接，骨体积（BV）较纯支架组提升 2.1-2.5 倍，血管新生丰富（图 6）；

骨质疏松性骨缺损：去卵巢大鼠股骨 3 mm 缺损，HHS-M 组 8 周骨体积分数（BV/TV）显著高于空白组（p<0.0001），骨小梁数量（Tb.N）增加、分离度（Tb.Sp）降低，新骨形成明显（图 7）；

图 6 | 空白组、纯 HHS 支架和 HHS - 细胞复合物（HHS-M、HHS-ME）修复大鼠大尺寸节段性骨缺损：（a）实验示意图；（b）术后 6 周和 12 周的 X 射线评估；（c）术后 6 周和 12 周的 μCT 重建图像及血管成像；（d）μCT 重建图像的定量分析；（e）术后 12 周的组织学染色。

图 7 | 空白组、纯 HHS 支架和 HHS-M 修复大鼠骨质疏松性骨缺损：（a）实验示意图；（b）术后 4 周和 8 周的 μCT 重建图像；（c）μCT 重建图像的定量分析；（d）术后 4 周和 8 周的组织学染色。

结论与展望

本研究通过一步同轴打印制备 GLN 复合水凝胶空心支架（HHS），利用其优异的力学响应性，开发机械辅助生物打印后策略，实现 4 秒快速、均匀、低损伤载细胞，且支持多细胞分区负载。该策略解决了传统生物打印的细胞损伤、负载不均问题，HHS 支架的力学稳定性和生物活性（含 Mg、Si 离子）协同负载细胞，有效修复大鼠临界尺寸节段性和骨质疏松性骨缺损。

未来可进一步探索该策略在软骨、肌肉等其他组织修复中的应用，优化墨水配方适配更多细胞类型，开发多细胞精准负载技术，推动其临床转化，为难治性组织缺损提供通用型再生治疗平台。

DOI：10.1038/s41467-024-48023-8

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