深圳先研院国家杰青Nat Chem Biol-合成生物学-利用整合技术工作流程加速基于菌毛的工程活材料设计

一、中文标题

利用整合技术工作流程加速基于菌毛的工程活材料设计（Accelerating the design of pili-enabled living materials using an integrative technological workflow）

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二、发表单位及通讯作者

• 主要单位：中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所

• 主要通讯作者：钟超（Chao Zhong）

三、科学问题

      如何系统挖掘、表征和工程化非致病菌中的内源性生物聚合物（如菌毛），以实现具有定制功能的工程活材料的高效设计与构建？

四、发表时间

• 正式刊期：2024年2月

• 链接：https://www.nature.com/articles/s41589-023-01489-x

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五、摘要

      本研究提出了一种整合生物信息学、结构生物学与合成生物学技术的系统工作流程，用于加速基于菌毛的工程活材料设计。首先开发了生物信息学软件BBSniffer，可从大规模基因组数据中高效挖掘目标生物聚合物及其生产菌株。以共价连接菌毛为例，在工业底盘菌谷氨酸棒杆菌中鉴定了其生物合成基因簇，并通过遗传操作与结构解析揭示了其组装机制。在此基础上，将菌毛编程为可功能化的细胞外蛋白质支架，成功实现了多酶共组装与纤维素降解，进一步耦合细胞内代谢通路，实现了纤维素生物质向番茄红素的高效转化。该工作为理性设计自组织活材料提供了系统化技术平台。

图1 设计流程

六、研究背景

      工程活材料是一类具有生命特征（如自生长、自修复、环境响应）的新型功能材料，在生物传感、环境修复、生物制造等领域展现出广阔前景。然而，其发展仍面临两大瓶颈：一是缺乏安全、易操作的非致病性工程底盘；二是可供编程的内源性结构生物聚合物资源有限。现有研究多集中于少数模式菌（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）及其淀粉样纤维，或特定系统如细菌纤维素生产者，限制了材料功能的多样性与适用性。

      自然界中微生物进化出丰富的生物聚合物（如蛋白纤维、多糖、细胞器），具有优异的物理化学与机械性能，是理想的活材料构建单元。然而，这些聚合物（尤其是非致病菌中的）的生物合成途径、组装机制及宿主信息尚不明确，难以被系统性挖掘与工程化。近年来，基因组挖掘、结构解析与通路工程在天然产物发现中已成功应用，启发了类似策略在生物聚合物资源开发中的潜力。

      为此，本研究提出了一种跨学科整合技术工作流程，旨在系统挖掘、表征和工程化非致病菌中的结构生物聚合物，为活材料的理性设计提供通用平台。

七、研究结果

结果1、开发BBSniffer软件用于挖掘生物聚合物生产菌

• 集成多个生物信息学工具与数据库，开发了软件BBSniffer，可根据目标生物聚合物的特征序列（如菌毛蛋白、纤维素合成酶等），从大规模细菌基因组中快速鉴定其生物合成基因簇及生产菌株。

• 软件可自动将菌株分类为病原菌、工业微生物及其他非致病菌，并基于系统发育距离对候选菌株进行排序，优先推荐遗传操作工具成熟、培养条件清晰的工业底盘。

• 以共价连接菌毛为例，从44.6万个细菌基因组中筛选出1,162个含CLP基因簇的菌株，最终推荐5株谷氨酸棒杆菌作为后续工程化对象。

图2 通过BBSniffer在自然界中挖掘功能生物聚合物生产细菌

结果2、揭示谷氨酸棒杆菌中CLP的组装机制

• 在工业菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 14067中鉴定出CLP基因簇（含三个菌毛蛋白基因spa1、spa2、spa3和两个分选酶基因srtC1、srtC2）。

• 通过遗传缺失、免疫电镜与质谱分析，证实Spa2是菌毛纤维的主要结构单元，其聚合依赖于分选酶催化的分子间异肽键连接。

• 解析了Spa2蛋白的晶体结构（分辨率2.73 Å），发现其包含三个Ig样结构域，形成三个分子内异肽键和两个二硫键，这些共价键共同维持了菌毛的机械稳定性。

图3 谷氨酸棒杆菌中CLP的组成及分子组装的探讨

结果3、将CLP编程为可功能化的细胞外蛋白质支架

• 基于结构信息，在Spa2的N端及M结构域中鉴定了四个可插入外源蛋白的位点，验证了mCherry、SpyTag/SpyCatcher、黏附肽Mfp3S、荧光蛋白Venus及纤维素酶等多种功能蛋白的融合表达与分泌。

• 融合蛋白可在细胞表面组装成功能性菌毛纤维，且不同大小和性质的蛋白对聚合效率影响不同，证明了CLP作为通用型细胞外蛋白质支架的潜力。

• 通过split-Venus系统验证了多蛋白在菌毛支架上的共组装能力，为构建多酶催化级联奠定了基础。

图4 CLP作为可编程细胞外蛋白支架的原位功能化

结果4、构建基于菌毛的工程活材料用于生物质转化

• 将内切葡聚糖酶TrEgl和β-葡萄糖苷酶SdBgl分别融合至Spa2，在谷氨酸棒杆菌表面共组装成降解纤维素的酶级联系统。

• 结合细胞内番茄红素合成途径，构建了能够直接以羧甲基纤维素钠为唯一碳源生产番茄红素的工程活材料。

• 实验表明，菌毛支架上共组装的酶系统降解纤维素效率比游离酶提高4倍，番茄红素产量达0.83 mg/g干细胞重量，实现了从废弃生物质到高值化合物的耦合转化。

图5 基于可编程谷氨酸棒杆菌菌毛结构的ELMs从生物废物中生产番茄红素

八、讨论

     本研究通过整合生物信息学、结构生物学与合成生物学，建立了一套从“挖掘—解析—设计—应用”的全链条活材料构建流程。BBSniffer软件突破了传统基因组挖掘工具局限于次级代谢产物的限制，为系统性开发生物聚合物资源提供了通用平台。以谷氨酸棒杆菌CLP为例，不仅阐明了一种新型菌毛的组装机制，更展示了其作为可编程细胞外支架在多功能活材料构建中的潜力。该工作流程具有高度扩展性，未来可应用于其他生物聚合物体系（如多糖、蛋白纳米笼等），并结合机器学习与蛋白质计算设计，进一步实现活材料功能的精准定制与性能优化。

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