免疫检查点阻断（ICB）疗法通过使用抗体阻断免疫检查点来激活抗肿瘤免疫反应。其中，CD47–SIRPα轴因在抑制巨噬细胞吞噬中的作用而备受关注。尽管靶向CD47–SIRPα的单克隆抗体在临床前研究中展现较高的疗效，但在临床试验中仍效果有限。肿瘤细胞表面的糖萼成为ICB治疗的潜在障碍。在乳腺癌和结直肠癌等肿瘤中，黏蛋白（如MUC1、MUC2和MUC5AC）的异常过表达和糖基化导致形成厚度达数百纳米的糖萼层。这些尺寸远超HER2（约15纳米）、PD-L1（约7纳米）和CD47（约10纳米）等治疗靶点的高度，从而阻碍药物结合。虽然细菌蛋白酶StcE能通过切割O-糖基化黏蛋白结构域来降解这一糖萼层屏障，但其治疗潜力受到脱靶毒性和高免疫原性的限制。
来自深圳湾实验室的饶浪等团队开发了一种细胞膜融合纳米囊泡（FNVs）仿生平台，该平台可同时展示StcE和CD47纳米抗体（nCD47），用于空间可控的糖萼降解和增强的检查点阻断。利用SpyTag/SpyCatcher系统，本文制备了展示StcE的纳米囊泡，随后将其与展示nCD47的纳米囊泡融合。最终获得的StcE-nCD47-FNVs保留了强效的黏蛋白水解活性，并展现出明确的理化性质。通过清除黏蛋白屏障，StcE-nCD47-FNVs显著增强了nCD47与肿瘤细胞表面CD47的结合，从而强化抗肿瘤免疫反应。更重要的是，得益于FNVs的延长循环和nCD47的肿瘤靶向性，StcE-nCD47-FNV平台相比游离StcE表现出更优的肿瘤富集性和生物安全性。在结直肠癌和乳腺癌小鼠模型中，StcE-nCD47-FNVs通过重塑肿瘤微环境显著抑制了肿瘤生长和转移，表现为M1型巨噬细胞极化和CD8+ T细胞浸润增加。通过将糖萼工程与囊泡纳米技术相结合，StcE-nCD47-FNVs为突破肿瘤糖萼屏障提供了一种安全、稳健且多功能的策略，有望推动下一代癌症免疫疗法的发展。相关工作以题为“Mucinase-engineered cell membrane nanovesicles degrade the glycocalyx shield to potentiate antitumor immunity”的文章发表在2026年04月21日的期刊《PNAS》。
【通过生物共轭策略在细胞表面展示StcE】
肿瘤细胞表面的致密糖萼构成了一道物理屏障，从而阻碍治疗药物（如nCD47）与CD47等免疫检查点的结合。为克服这一障碍，本文开发了一种基于纳米囊泡（NV）的系统，利用黏蛋白特异性蛋白酶StcE，假设通过靶向降解糖萼能够暴露这些被遮蔽的表位（图1A）。在本研究中，StcE的结构删除了C端X409结构域，以减少非特异性结合。首先，按照此前报道的方法表达并纯化了StcE及其无活性突变体（StcE E447D，缺乏酶活性，以下简称StcE*）。本文通过切割重组C1酯酶抑制剂（C1INH）底物以及降低HeLa细胞上MUC1水平，验证了StcE的酶活性。
图1 黏蛋白酶StcE在HEK293T细胞表面的生物偶联展示
【融合细胞囊泡的制备与表征】
在建立StcE展示平台后，本文进一步评估了工程化HEK293T-StcE细胞清除肿瘤细胞表面黏蛋白的能力（图2A）。流式细胞术证实，HEK293T-StcE细胞能有效降解HeLa细胞上的MUC1（图2B）。该系统通过调节StcE-ST浓度，实现了对HeLa细胞黏蛋白的可控降解（图2C）。此外，HEK293T-StcE细胞还能高效降解CT26和4T1细胞表面的黏蛋白，表明其具有广泛的适用性（图2D–G）。随后，通过超声和挤压法从这些工程化细胞中制备了纳米囊泡（StcE-NVs）。所得的StcE-NVs保留了强大的黏蛋白酶活性，成功降低了HeLa细胞上的MUC1水平，而由表达StcE*的细胞制备的对照囊泡（StcE*-NVs）则无此效果。StcE-NVs在4°C储存时至少能维持一周的稳定水解活性。然而，由于StcE-NVs来源于不具备天然归巢能力的正常细胞，且StcE本身不具有细胞类型特异性，因此其缺乏肿瘤靶向能力。
图2 多功能纳米囊泡的制备与表征
【StcE-nCD47-FNVs增强肿瘤蓄积并改善系统生物相容性】
肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞上的抑制性受体SIRPα结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用。StcE-nCD47-FNVs的设计旨在通过同步降解糖萼并阻断CD47-SIRPα信号轴来克服这一障碍。首先，本文验证了nCD47组分的结合特异性。通过构建并鉴定CD47敲低（CD47KD）肿瘤细胞（图3A–C），免疫荧光成像显示，FITC标记的nCD47-NVs能与野生型细胞高效结合，但对CD47KD细胞的结合能力极低，证实了其CD47特异性结合能力。与nCD47-NVs相比，StcE-nCD47-FNVs表现出更强的结合能力，而StcE*-nCD47-FNVs的结合能力与nCD47-NVs相当，表明StcE-nCD47-FNVs结合能力的增强主要归因于StcE介导的糖萼降解（图3D–E）。综上，本研究表明StcE介导的糖萼降解能增强CD47靶向能力，并促进巨噬细胞的吞噬作用。
图3 StcE-nCD47-FNVs用于靶向CD47检查点阻断及生物相容性评估
【StcE-nCD47-FNVs 在皮下肿瘤模型中的体内抗肿瘤疗效】
受体外研究结果的鼓舞，本文接下来评估了StcE-nCD47-FNVs在CT26荷瘤小鼠中的治疗效果。在接种后第7天，小鼠被随机分为五个治疗组，并每隔一天进行静脉注射：G1（PBS组）、G2（FNVs组）、G3（StcE-FNVs组，仅水解糖萼）、G4（nCD47-FNVs组，仅阻断CD47）以及G5（StcE-nCD47-FNVs组，联合治疗）（图4A）。所有组小鼠均注射120 μL浓度为1 mg/mL的囊泡悬液，该剂量基于前期同时评估抗肿瘤疗效和系统安全性的优化实验确定。对照组（G1、G2）肿瘤生长迅速，而各治疗组均表现出不同程度的抑制效果。单一疗法组（G3和G4）仅能中等程度地抑制肿瘤进展。相比之下，G5联合疗法产生了显著强大的抗肿瘤效果，肿瘤抑制率达到95.83 ± 2.71%（图4B–C）。这种增强的疗效归因于一种协同机制：初始的nCD47结合促进了StcE介导的糖萼水解，进而暴露出新的表位，从而提高了整体囊泡的结合能力。重要的是，这种强效疗效是在未引起显著体重减轻的情况下实现的，表明该治疗方案具有良好的安全性（图4D）。生存分析进一步证实了这些结果，G5组小鼠的生存期较其他所有组均显著延长（图4E）。
图4 不同治疗方式在CT26荷瘤小鼠体内的抗肿瘤疗效
【StcE-nCD47-FNVs 在转移性肿瘤模型中的体内抗肿瘤疗效】
为了在更严格的转移性模型中评估StcE-nCD47-FNVs的疗效，本文采用了4T1肺转移模型。小鼠静脉注射表达荧光素酶的4T1细胞，随后随机分为五个治疗组：G1（PBS组）、G2（FNVs组）、G3（StcE-FNVs组）、G4（nCD47-FNVs组）和G5（StcE-nCD47-FNVs组）。每2天给药一次，并通过体内生物发光成像监测肿瘤进展（图5A）。21天后，体内及离体成像均显示，G5（StcE-nCD47-FNVs）治疗对肺转移的抑制作用最为显著（图5B）。尽管单一疗法（G3和G4）仅提供轻微且有限的治疗效果，但G5组小鼠的肺转移结节在大小和数量上均有所减少，肿瘤抑制率达到92.90 ± 3.71%（图5C–E）。H&E染色组织学分析进一步证实了这些发现。关键的是，在第35天时，接受StcE-nCD47-FNVs治疗的小鼠存活率为100%，突显了联合疗法在转移性环境中的强大治疗效果（图5F）。
图5 在4T1肺转移模型中的体内抗肿瘤疗效
【总结与展望】
本研究开发了一种多功能融合细胞来源囊泡平台，其通过将糖萼降解与CD47检查点阻断相结合，协同克服肿瘤免疫逃逸。本文首先利用SpyTag-SpyCatcher系统制备StcE-NVs以高效水解黏蛋白，随后将其与源自工程化肿瘤细胞的nCD47-NVs融合，形成具有明确理化性质且保留黏蛋白水解活性的StcE-nCD47-FNVs。通过降解黏蛋白屏障，StcE-nCD47-FNVs增强了nCD47与肿瘤细胞CD47的结合能力，进而阻断CD47-SIRPα轴并显著促进巨噬细胞吞噬作用。此外，与游离StcE相比，StcE-nCD47-FNVs在体内具有更优的肿瘤蓄积能力和安全性。在两个小鼠肿瘤模型中，StcE-nCD47-FNVs显著抑制了原发肿瘤生长和转移，延长了生存期，并通过促进M1型巨噬细胞极化和细胞毒性CD8+ T细胞浸润重塑了肿瘤微环境。
参考资料：
https://doi.org/10.1073/pnas.2529792123
来源：EngineeringForLife
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