深圳大学《自然·通讯》:SDRSRS——同时双拉曼位移无扫描受激拉曼散射显微镜实现无标记生物分子成像
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种基于分子振动的新型非线性光学成像技术，能够在不使用外源标记的情况下，对活体系统中的分子化学特征进行高灵敏度、高精度、高特异性的分析，在生物医学领域具有重要价值。然而，传统SRS成像需要通过拉曼位移扫描来获取化学特异性，这一过程耗时较长，限制了其在实时生物学研究中的应用。尽管脉冲整形、光谱聚焦、多路复用等方法已在一定程度上提升了扫描速度，但这些技术大多采用逐帧扫描方式，采集完整光谱仍需数分钟。如何在保持高化学特异性的同时实现快速成像，尤其是同时获取不同分子振动信息，一直是该领域亟待解决的关键难题。针对上述挑战，深圳大学物理与光电工程学院刘丽炜教授团队提出了一种同时双拉曼位移无扫描受激拉曼散射（SDRSRS）显微镜。该方法利用双折射晶体产生可控的光程差，结合正交偏振和双相位调制，实现了无需光谱扫描即可同时捕获两种不同分子振动信号（如CH₃和CH₂）的双通道成像。系统通过定制双通道相移探测器和正交解调技术，在标准飞秒光谱聚焦SRS显微镜上增加了被动光学延迟模块和紧凑的双通道锁相检测电路，可灵活更换不同长度的双折射晶体来调节拉曼位移间隔，从而适配不同的分子振动对。与传统的逐帧双色SRS或全光谱扫描相比，SDRSRS将双通道采集时间从约1秒缩短至0.26秒（512×512像素），加速超过10倍，同时通过共线平衡检测模式实现了11 dB的信噪比提升，并兼容双光子自发荧光和二次谐波等成像模态。相关内容以“Simultaneous dual-Raman-shift scanning-free stimulated Raman scattering microscopy for label-free biomolecular imaging”为题，发表在Nature Communications。图1. SDRSRS系统示意图： (a) 整体激发与检测系统，包括啁啾脉冲模块（实现高光谱分辨率）、同频异相调制模块、显微镜模块、双通道相移探测模块以及信号解调与数据采集模块。(b) 斯托克斯光束的强度调制以及泵浦光和斯托克斯光的偏振态。(c) 定制双折射晶体将泵浦光和斯托克斯光在时间上分离为水平偏振对（E_p,H、E_s,H）和垂直偏振对（E_p,V、E_s,V），其中E_s,H和E_s,V具有不同相移。(d) 双通道相移检测系统，包括沃拉斯顿棱镜、光电二极管、印刷电路板、π/2相移电路及锁相放大器。图2. SDRSRS的原理与光谱验证： (a) 激发光路：双折射晶体在泵浦光和斯托克斯光中引入不同光程差（时间延迟Δt₁和Δt₂），水平偏振对和垂直偏振对分别激发不同分子。(b) 检测光路：泵浦光束经沃拉斯顿棱镜空间分离，由定制双通道相移探测器检测，对检测到的E_p,H信号施加γ=π/2的相移。(c) 通过双折射晶体后水平与垂直偏振斯托克斯光强度的测量结果。(d,e) 使用无双折射晶体光谱扫描获得的DMSO(d)和甲醇(MeOH)(e)的SRS光谱。(f) 拉曼位移差(ΔΩ)随双折射晶体长度变化的模拟与测量结果。(g,h) 使用3 cm(g)或4 cm(h)双折射晶体获得的DMSO(g)和MeOH(h)的SRS光谱。(i) PMMA和PS微球在(j)所示拉曼位移坐标下的同时对比SRS成像，实验独立重复至少三次。(k) 图i中实线位置的光强分布曲线。(l) MeOH和PMMA在(m)所示拉曼位移坐标下的同时对比SRS成像。(m) 对应拉曼光谱。比例尺20 μm。图3. 活细胞无标记SDRSRS验证： (a) 活细胞在2940 cm⁻¹和2853 cm⁻¹拉曼位移下的SDRSRS图像，白色虚线圆指示细胞核，白色箭头指示脂滴。(b) 活细胞在2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹拉曼位移下的SDRSRS图像，白色虚线勾勒细胞轮廓。(c) 细胞SRS光谱，红色和蓝色条带指示同时采集的拉曼位移位置。(d) 细胞中脂滴尺寸（面积）的频率分布直方图。(e) 低脂含量细胞与富脂细胞在2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹下的组分强度（Tukey箱线图）及组分比（小提琴图）比较（n=16），统计学差异采用双尾Mann-Whitney检验。(f) 典型细胞变化的时间序列图像。(g) 相对信号强度随时间变化曲线。(h) 富脂细胞的局部放大图像，内嵌线图显示相对强度随时间变化，内嵌柱状图比较X和Y通道强度（n=388个时间点）。(i) 图h中框选区域的放大视图，显示脂滴动态，白色箭头指示脂滴波方向。(j) CH₃和CH₂强度随时间变化曲线，虚线圆圈对应图i中的时间点。比例尺：20 μm（a,b,f,h），10 μm（i）。图4. 小鼠肝癌的SDRSRS图像与统计分析： (a) 小鼠肝癌模型（上）及抗体治疗示意（下）。(b) 治疗前后肝癌组织同时采集的2930 cm⁻¹（X）和2843 cm⁻¹（Y）SRS图像及组织病理学图像。白色箭头指示脂滴，虚线圆圈勾勒脂肪区域。(c) 正常肝、肝癌、CCR8治疗组（CRT）和PD-1治疗组（PDT）组织在2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹下的归一化强度Tukey箱线图（n=160），统计学差异采用双尾Mann-Whitney检验。(d) 基于2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹组分强度计算的不同组织间Pearson相关性。(e) 不同组织2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹组分比的Tukey箱线图（n=160），统计学差异采用双尾Mann-Whitney检验。(f) 肝癌、CRT、PDT相对于正常组织的ROC曲线及AUC值（n=160）。(g) PCA聚类分析，右侧展示CRT的代表性SDRSRS图像。(h) UMAP降维分析，右侧展示PDT的代表性SDRSRS图像。比例尺20 μm。图5. 人结直肠癌组织的SDRSRS图像与统计分析： (a) 结直肠癌样本同时采集的2930 cm⁻¹（X）和2843 cm⁻¹（Y）图像，展示代表性图像（n=84个独立组织区域）。(b) 利用本系统进行无标记快速诊断分析的工作流程。(c) 结直肠癌的PCA聚类分析（左）及结果（右），红色圆圈为癌组织，蓝色圆圈为癌旁组织。(d) 基于2930 cm⁻¹和2843 cm⁻¹组分比计算的癌与癌旁组织间Pearson相关性。(e) 癌与癌旁组织的拉曼组分强度及组分比Tukey箱线图（n=84），统计学差异采用双尾Mann-Whitney检验。(f) 癌与癌旁样本中组分比的相对频率分布（n=84）。(g) 结直肠癌旁组织同时采集的2930 cm⁻¹（X）和2843 cm⁻¹（Y）图像（n=84），展示代表性图像。比例尺20 μm。本研究提出的SDRSRS显微镜通过在标准飞秒光谱聚焦SRS系统中集成双折射晶体和双通道相移检测模块，首次实现了无需光谱扫描的同时双拉曼位移无标记成像。该技术能够在单次曝光中严格同步采集CH₃和CH₂两种分子振动信号，避免了逐帧采集带来的时间失配和生化比失真，在活细胞中成功捕捉了脂滴的动态转运、融合和“脂波”传播过程，并定量分析了脂滴尺寸分布和CH₃/CH₂比值与细胞代谢状态的相关性。在临床前应用中，SDRSRS区分了肝癌免疫治疗（CCR8抗体与PD-1抗体）的不同反应模式，通过主成分分析和UMAP降维揭示了治疗诱导的生化特征变化；在人类结直肠癌组织中，该技术清晰区分了癌与癌旁组织，并建立了基于CH₃/CH₂比值的快速诊断工作流程。此外，SDRSRS还具备共线平衡检测模式（信噪比提升11 dB）和与其他成像模态（双光子自发荧光、二次谐波）的兼容性。这项工作为无标记、实时、高特异性的生物分子成像提供了有力工具，在活细胞代谢监测、临床病理快速诊断和药物反应评估中具有广阔的应用前景。
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https://doi.org/10.1038/s41467-026-73391-8来源：BioMed科技声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！
