深圳先研院国家杰青携手上海交通大学国家杰青Nature-合成生物学-利用工程化海洋细菌Vibrio natriegens生物修复复杂有机污染物

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一、中文标题

利用工程化海洋细菌Vibrio natriegens生物修复复杂有机污染物（Bioremediation of complex organic pollutants by engineered Vibrio natriegens）

二、发表单位及通讯作者

• 发表单位：

1. 中国科学院深圳先进技术研究院，深圳合成生物学研究所

2. 上海交通大学，生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室

3. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所

• 通讯作者：戴俊彪（daijunbiao@caas.cn）、唐鸿志（tanghongzhi@sjtu.edu.cn）

三、科学问题

如何利用合成生物学方法，构建一个能够耐受高盐环境并同时高效降解多种复杂有机污染物（从单环芳烃到多环芳烃）的工程微生物，以解决工业废水、石油污染和塑料污染等海洋环境治理难题？

四、发表时间

• 日期：2025年5月7日

• 链接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-08947-7

五、摘要

       本研究通过合成生物学策略，成功将快速生长的海洋细菌Vibrio natriegens改造为一种强大的生物修复底盘。研究人员首先通过过表达自然转化主调控基因tfoX，开发了高效的、无需辅助质粒的基因转移方法（INTIMATE）。随后，化学合成了九个降解基因簇，并通过酵母组装，最终将五个总长43 kb的基因簇迭代整合到V. natriegens Vmax基因组的特定中性位点。所获得的最终工程菌株VCOD-15具备同时降解联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯五种有机污染物的能力。该菌株在模拟海水、高盐工业废水及污染土壤中均表现出高效的修复性能，为复杂污染环境，尤其是高盐环境的治理提供了新的技术方案。

六、研究背景

      工业废水、石油泄漏和塑料污染等含有大量有毒、致突变且难降解的复杂有机污染物（如单环和多环芳烃），对全球海洋生态安全和人类健康构成严重威胁。利用微生物进行生物修复是一种环境友好的治理策略，但面临两大瓶颈：一是天然降解菌通常只能降解单一或少数结构相似的污染物，难以应对成分复杂的混合污染；二是多数高效降解菌对高盐环境耐受性差，而许多工业废水（如氯碱厂、炼油厂废水）和海洋环境本身具有高盐特性。

      合成生物学为创造多功能“超级”降解菌提供了可能，其核心在于将多个来源的降解途径整合到一个合适的“底盘”微生物中。Vibrio natriegens作为一种生长速度极快（倍增时间<10分钟）、对高盐环境具有天然耐受性且被公认为生物安全的海洋细菌，是理想的合成生物学底盘。尽管已有部分基因组编辑工具（如CRISPR）用于该菌，但要实现多个大型基因簇（总长数十kb）的稳定、高效整合仍极具挑战，特别是要保证各途径的协调表达且不影响底盘细胞的生长适应性。

      因此，本研究旨在开发一种系统性的工程化平台，通过增强V. natriegens的基因接纳能力，并将针对不同污染物的降解途径模块化地组装到其基因组中，构建出一种能够同时、高效降解多种典型芳烃污染物的通用型工程菌，并验证其在真实高盐污染环境（废水和土壤）中的修复效能。

七、研究结果

结果1、底盘菌株的选择与优化

     研究首先比较了V. natriegens Vmax与几种经典降解菌（如Pseudomonas putida KT2440）在不同盐度培养基中的生长。结果显示，在低盐条件下Vmax生长不占优势，但在高盐（30-50 g/L NaCl）条件下，其生物量和生长速率显著优于其他菌株，且在污染物存在时仍能保持生长，显示出优异的高盐与污染物耐受性。转录组分析发现，在污染物胁迫下，Vmax中涉及外排泵（如marA, acrAB-tolC）和ABC转运蛋白的多个基因显著上调，揭示了其内在的抗性机制。

图1 底盘菌株的选择

结果2、开发高效基因组整合平台（INTIMATE方法）

       为提高Vmax的基因导入效率，研究将来自Vibrio cholerae的自然转化主调控基因tfoX整合到Vmax染色体1的特定位点，构建了VCOD-2菌株。该菌株的自然转化效率（对质粒和长片段线性DNA）得到显著提升，且生长未受影响。基于此，研究团队开发了“基于tfoX效应扩增的迭代自然转化”（INTIMATE）方法。通过筛选，确定了染色体2上的chr2_297位点作为稳定、高表达的外源基因整合“中性位点”。

图2 发展改造方法

结果3、降解基因簇的设计、合成与初步验证

        研究选取了九条针对不同芳烃污染物（苯、甲苯、苯酚、联苯、萘、二苯并呋喃、二苯并噻吩）的已知降解途径。对这些基因簇进行化学合成、密码子优化，并在酿酒酵母中进行组装。随后，使用INTIMATE方法将它们分别插入VCOD-2的chr2_297位点，得到VCOD-3至VCOD-11菌株。功能验证表明，其中五个菌株（VCOD-3至VCOD-7）分别能有效降解联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯，并检测到预期的代谢中间产物（如儿茶酚、水杨酸、苯甲酸等）。

图3 插入和验证生物修复效果

结果4、构建多功能复合降解菌株VCOD-15

        为实现单一菌株同时降解多种污染物，研究利用INTIMATE方法，以迭代的方式将上述五个有效的降解基因簇（bph, dmp, nah, dbf, xy，总长43 kb）依次串联整合到VCOD-2的同一基因位点，最终获得工程菌VCOD-15。定量PCR证实所有引入的降解基因均能有效转录。性能测试表明，VCOD-15能在48小时内同时高效去除混合污染物中的联苯（100%）、苯酚（60.7%）、萘（71.8%）、二苯并呋喃（89.3%）和甲苯（89.9%），且菌株生长稳定，遗传性经过连续传代得到验证。

图4 测试复杂污水的修复

结果5、在真实工业废水中的修复效能评估

        研究采集了来自氯碱厂（BZ系列，盐度~102.5 g/L）和炼油厂（DL系列，盐度~52.5 g/L）的高盐工业废水。Vmax是测试菌株中唯一能在最高盐废水中生长的菌种。将VCOD-15应用于活性污泥反应器和多并联生物反应器中处理实际废水。在非灭菌、开放系统中，VCOD-15在48小时内对废水中添加的五种目标污染物去除率高达79.7%-99.7%。微生物群落分析显示，接种的VCOD-15能在废水中成功定殖并维持一定比例，证明其具备与土著微生物竞争的能力。

图5 工业废水的生物修复

结果6、在污染土壤中的修复潜力验证

        研究进一步在实验室条件下评估了VCOD-15对污染土壤的修复能力。使用含有稳定同位素标记污染物的土壤进行实验，经过VCOD-15处理8天后，能有效降解土壤中的联苯、苯酚、萘和二苯并呋喃。通过高分辨气相色谱-质谱联用技术，检测到了标记的降解中间产物，直接证实了污染物在土壤中被VCOD-15代谢转化，而非简单的吸附或挥发。

八、讨论

       本研究成功构建了全球首例能够同时降解多种典型芳烃污染物的工程化V. natriegens菌株VCOD-15，并系统验证了其在高盐废水及土壤环境中的高效修复能力。其核心创新在于：（1）通过引入tfoX开发的INTIMATE方法，实现了大型基因簇的高效、迭代整合，为复杂生物系统的构建提供了强大工具；（2）充分利用了V. natriegens生长快、耐高盐的天然优势，解决了传统生物修复技术在高盐环境中的适应性难题。尽管VCOD-15尚不能将污染物完全矿化或以其作为唯一碳源生长，但本研究建立的平台为后续升级（如引入完全矿化途径、拓展底物谱至新兴污染物如微塑料）奠定了坚实基础。该工作展示了合成生物学在解决严峻环境问题方面的巨大应用潜力，为发展下一代智能、高效的生物修复制剂提供了新范式。

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