广州妇女儿童医疗中心 | 融合血小板 - 中性粒细胞膜的智能纳米粒,破解急性肺损伤治疗难题

针对急性肺损伤（ALI）缺乏特效治疗、现有药物靶向性差且生物利用度低的问题，设计了负载表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的巯基酮（TK）功能化介孔硅纳米粒（MSN），并包裹血小板 - 中性粒细胞混合膜（PNM）构建 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒；该颗粒借助混合膜实现炎症部位靶向与免疫逃逸，通过 TK 键响应高活性氧（ROS）释放 EGCG，既清除过量 ROS 缓解氧化应激，又激活 MAPK/BNIP3 通路增强肺上皮细胞自噬，同时降低促炎细胞因子水平，最终在体内外实验中有效改善 ALI，为 ALI 治疗提供了兼具靶向性、抗氧化和抗炎功效的新型策略。

研究亮点

本研究构建的 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒具有双重炎症靶向与免疫逃逸能力，创新采用血小板 - 中性粒细胞混合膜包裹，强化炎症部位靶向性；TK 键修饰实现 ROS 响应型药物释放，提升 EGCG 生物利用度；同步发挥 ROS 清除、抗炎作用，通过激活 MAPK/BNIP3 通路增强自噬，多机制协同改善 ALI；体内外实验证实其生物相容性良好、治疗效果显著，为 ALI 治疗提供了新型高效的纳米治疗平台。

全文归纳总结

结果图解

Figure 1：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的制备与核心特性验证

该图通过多种表征手段证实了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的成功制备及关键功能特性。TEM 观察显示血小板 - 中性粒细胞混合膜（PNM）已成功包裹在 EGCG@MSN-TK 表面，形成了预期的核壳结构；元素 mapping 结果检测到 Si、O、N、S 等特征元素的均匀分布，印证了 EGCG 和 mPEG-TK 在纳米颗粒中的有效负载。DLS 测试表明该纳米颗粒平均粒径约为 122 nm，符合纳米药物递送系统的尺寸要求；UV-vis 光谱证实 EGCG 成功载入介孔硅（MSN），负载效率达 24.2%。Western blot 检测到血小板和中性粒细胞的特征膜蛋白（如 LFA-1、CD41、CD61 等）在纳米颗粒表面表达，进一步验证了混合膜的成功包覆；药物释放实验则显示，该纳米颗粒的 EGCG 释放具有显著的 H₂O₂浓度依赖性，高 H₂O₂环境下（模拟炎症部位氧化应激状态）释放效率显著提升，这一特性为其在炎症部位的智能药物释放提供了支撑。

Figure 2：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的生物相容性评估

该图通过体内外实验系统验证了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的生物安全性。体外细胞实验中，CCK8 法检测显示经该纳米颗粒处理的 MLE12 细胞活力与正常细胞无显著差异，流式细胞术也未检测到明显的细胞凋亡现象，表明其无明显细胞毒性。体内实验中，对小鼠尾静脉注射纳米颗粒后，7 天内实验组与对照组小鼠的体重变化无显著差异；血常规分析显示红细胞、白细胞、中性粒细胞等指标均未出现异常波动；H&E 染色结果显示小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均未出现明显病理损伤。这些结果共同表明，PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒具有良好的生物相容性，为其后续的体内治疗应用奠定了安全基础。

Figure 3：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的靶向性与 ROS 清除及抗炎能力验证

该图聚焦于纳米颗粒的核心治疗相关功能，证实了其优异的炎症部位靶向性、ROS 清除能力及抗炎效果。靶向性实验中，体外对 H₂O₂诱导的 MLE12 细胞（模拟炎症状态肺上皮细胞）的摄取实验显示，PNM 包裹的纳米颗粒荧光强度显著高于单一细胞膜包裹的纳米颗粒，表明混合膜增强了细胞靶向结合能力；体内活体成像显示，注射 PNM-EGCG@MSN-TK 的小鼠肺部荧光信号最强，证实其在 ALI 模型小鼠体内具有良好的肺组织靶向性。ROS 清除实验中，DCFH 探针检测显示，与单纯 MSN 相比，EGCG@MSN-TK、PM-EGCG@MSN-TK、NM-EGCG@MSN-TK 及 PNM-EGCG@MSN-TK 均具有 ROS 清除能力，其中 PNM-EGCG@MSN-TK 的清除效果最为显著，可有效缓解细胞内氧化应激。此外，RT-qPCR 检测显示该纳米颗粒能显著降低 H₂O₂诱导的 MLE12 细胞中 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子的 mRNA 表达水平，证实其具有明确的抗炎作用。

Figure 4：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒对 H₂O₂诱导的 MLE12 细胞自噬增强与凋亡抑制作用

该图通过一系列细胞实验揭示了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒通过增强自噬、抑制凋亡保护肺上皮细胞的机制。TEM 观察显示，经该纳米颗粒处理的 H₂O₂损伤 MLE12 细胞中，自噬体数量显著多于 EGCG@MSN-TK 处理组及对照组；免疫荧光和 Western blot 检测进一步证实，自噬相关蛋白 LC3 和 Beclin-1 的表达水平显著升高，而自噬底物蛋白 P62 的表达水平显著降低，表明该纳米颗粒能有效增强损伤肺上皮细胞的自噬活性。同时，流式细胞术检测显示，PNM-EGCG@MSN-TK 处理可显著降低 H₂O₂诱导的 MLE12 细胞凋亡率；Western blot 检测显示凋亡相关蛋白 Bax 的表达被显著抑制，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达显著上调。这些结果表明，PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒可通过增强自噬、抑制凋亡两种途径，维持氧化应激损伤肺上皮细胞的稳态，减轻细胞损伤。

Figure 5：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒通过 MAPK/BNIP3 通路调控自噬的机制验证

该图深入探究了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒增强细胞自噬的分子机制，证实其通过激活 MAPK/BNIP3 通路发挥作用。免疫荧光检测显示，该纳米颗粒处理后，H₂O₂损伤的 MLE12 细胞中 BNIP3 蛋白的表达水平显著升高，而 BNIP3 作为 Bcl-2 家族成员，可通过竞争性结合 Bcl-2 释放 Beclin-1，进而启动自噬过程。Western blot 检测进一步显示，与对照组和单纯 H₂O₂处理组相比，PNM-EGCG@MSN-TK 处理组中 p-P38 蛋白的磷酸化水平显著上调，而总 P38 蛋白表达无明显变化，表明 MAPK 通路中的 P38 亚型被激活。结合此前自噬相关指标的变化，这些结果共同证实，PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒通过激活 P38 MAPK 通路，上调 BNIP3 的表达，进而促进 Beclin-1 介导的自噬激活，最终实现对肺上皮细胞的保护作用。

Figure 6：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒在体内缓解 ALI 的治疗效果验证

该图通过 LPS 诱导的 ALI 小鼠模型，验证了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒的体内治疗效果。实验设计中，小鼠经鼻滴 LPS 建立 ALI 模型后，尾静脉注射纳米颗粒进行治疗，14 天后评估肺组织损伤情况。H&E 染色结果显示，模型组小鼠肺组织出现明显的肺间质增厚、肺泡结构破坏、炎症细胞浸润及出血等典型 ALI 病理特征；而 PNM-EGCG@MSN-TK 处理组的肺组织病理损伤显著减轻，肺泡结构相对完整，炎症浸润明显减少，且治疗效果优于 EGCG@MSN-TK 组。TUNEL 染色结果显示，PNM-EGCG@MSN-TK 处理可显著降低肺组织细胞的凋亡率，与模型组和 EGCG@MSN-TK 组相比，凋亡细胞数量明显减少。这些体内实验结果直接证实，PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒能够有效减轻 LPS 诱导的小鼠肺组织损伤，抑制肺细胞凋亡，具有显著的 ALI 治疗效果。

Figure 7：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒在体内通过 MAPK/BNIP3 通路增强自噬的机制验证

该图在体内层面进一步验证了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒通过激活 MAPK/BNIP3 通路增强自噬，进而发挥 ALI 治疗作用的分子机制。免疫荧光检测显示，与模型组和 EGCG@MSN-TK 组相比，PNM-EGCG@MSN-TK 处理组小鼠肺组织中自噬相关蛋白 LC3 的表达水平显著升高，表明该纳米颗粒在体内可有效增强肺组织的自噬活性。Western blot 检测进一步证实，PNM-EGCG@MSN-TK 处理后，小鼠肺组织中 BNIP3 蛋白表达显著上调，p-P38 蛋白的磷酸化水平明显升高，同时自噬标志蛋白 Beclin-1 表达增加、P62 表达减少，与体外细胞实验结果一致。这些体内机制数据表明，PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒在 ALI 小鼠模型中，同样通过激活 P38 MAPK/BNIP3 通路，增强肺组织细胞自噬，从而减轻肺损伤，进一步印证了其治疗机制的一致性。

Figure 8：PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒在体内降低 ALI 小鼠炎症水平的效果验证

该图专门评估了 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒对 ALI 小鼠体内炎症反应的抑制作用。RT-qPCR 检测显示，与模型组相比，PNM-EGCG@MSN-TK 处理组小鼠肺组织中 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子的 mRNA 表达水平显著降低；免疫组化分析进一步从蛋白水平证实，这些促炎细胞因子在肺组织中的表达量明显减少，且其抗炎效果优于 EGCG@MSN-TK 组。炎症反应过度激活是 ALI 发生发展的核心病理环节，这些结果表明 PNM-EGCG@MSN-TK 纳米颗粒能够有效抑制 ALI 小鼠体内的炎症应答，减少促炎因子释放，这也是其缓解肺组织损伤、发挥治疗作用的重要机制之一。