合作文章| 突破 poly(A)限制:深圳基因组所刘永鑫团队联合贝纳基因、诺唯赞等建立纳米孔非编码rna测序新策略
- 2026-06-10 05:22:37
长非编码 RNA（long non-coding RNA, lncRNA）虽然不编码蛋白质，却广泛参与基因表达调控、细胞分化、环境适应和应激响应等重要生命过程。随着高通量测序技术的发展，lncRNA 研究逐渐从“有没有”走向“是哪一种异构体、全长结构如何、是否具有特定表达模式”。然而，传统短读长 lncRNA-seq 在 lncRNA 研究中仍存在明显局限：一方面，许多 lncRNA 表达量较低，难以被稳定捕获；另一方面，短读长测序难以准确重建完整转录本结构，尤其是复杂剪接异构体。
2026年5月27日，Nature旗下期刊Communications Biology（中科院一区)在线发表了中国农业科学院农业基因组研究所刘永鑫团队的研究成果，文章题目为“An rRNA-depleted full-length transcriptome strategy using nanopore sequencing for identification of novel lncRNA isoforms”。 研究建立了一套基于 Oxford Nanopore Technologies R10.4.1 平台的 rRNA 去除全长转录组测序策略，命名为 NanoncRNA-seq。该方法能够同时捕获 poly(A)+ 和 poly(A)- RNA，并用于新型 lncRNA 异构体的识别。贝纳基因研究院张天缘副研究员是论文第一作者，陈洁为本研究的共同第一作者，中央民族大学药学院马婷玉博士和中国农业科学院农业基因组研究所刘永鑫研究员为共同通讯作者。贝纳基因冀金龙，田朝阳，陈虎等12位作者共同参与了本项研究。。
研究设计
NanoncRNA-seq 的核心设计是：通过 rRNA 探针结合 RNase H 和 DNase I 消化，有效去除 rRNA 和 DNA 污染，同时尽可能保留 poly(A)+ 与 poly(A)- RNA。随后通过特殊设计的接头和模板转换反转录策略构建全长 cDNA 文库，并使用 R10.4.1 flow cell 进行 Nanopore 测序。
图 1｜NanoncRNA-seq 整体实验流程与分析框架
在ONT文库构建中，合成了定制的正向引物，其两端都经过修饰：5'端携带App修饰，3'端使用C3间隔物修饰以防止非特异性连接和RNA连接产物的形成。App是一种预活化的二磷酸供体，可通过T4 RNA连接酶2的催化，特异性促进RNA或DNA的末端连接，从而减少非特异性副产物的生成。此外，在引物的3'端附加了包含多个混合“n”核苷酸的序列，以通过减少空间位阻并提高酶连接期间RNA末端的相容性来提升连接效率。随后将3' NV接头与RNA连接，接着进行逆转录和PCR扩增。文库使用ONT R10.4.1流动单元进行测序。
结论1 R10.4.1 平台实现高质量长读长数据产出
在数据质量方面，ONT R10.4.1 平台表现稳定。本研究中，Nanopore平均 Q-score 达到 22.35。这说明，随着 R10.4.1 flow cell 和新一代 basecaller 的发展，Nanopore 测序在转录组研究中的准确性已经显著提升。与此同时，rRNA 去除效果良好，这表明该 rRNA 去除策略可以同时适用于短读长和长读长测序，为后续 mRNA 与 lncRNA 联合分析提供了高质量数据基础。
图 2｜Nanopore 与 Illumina 数据质量、rRNA 去除效率和比对情况
结论2 ONT 与 Illumina 表达谱高度一致，各有优势
为了评估 NanoncRNA-seq 在表达定量中的可靠性，我们比较了 ONT 与 Illumina 平台的基因表达模式。结果显示ONT 平台内部样本相关性同样很高，ρ ≥ 0.986，ONT 与 Illumina 跨平台相关性为 0.697–0.733，这说明两种平台在整体表达趋势上具有较好一致性。进一步分析差异表达基因发现：ONT 与 Illumina 共同识别了 80.0% 的差异表达基因。KEGG 富集分析显示，ONT 和 Illumina 识别出的差异基因均涉及多个关键代谢通路。这些结果表明，NanoncRNA-seq 不仅可以用于 lncRNA 发现，也能够较好地反映 mRNA 表达变化和生物学状态差异。
图 3｜ONT 与 Illumina 表达谱一致性及功能富集分析
亮点三：长读长测序更适合解析转录本结构
完整转录本结构重建是 lncRNA 研究中的关键步骤。为了系统评价不同分析工具的表现，我们比较了多种转录本重建方法，结果显示，不同软件在转录本结构识别上具有明显差异。
Illumina 数据在已知转录本 Full Splice Match（FSM）类别中比例较高，说明短读长测序对已知注释基因的检测较稳定。长读长测序更适合发现新的转录本结构，尤其适合解析传统短读长方法难以准确重建的复杂异构体。在表达分布方面，ONT 数据显示出更宽的 TPM 分布范围，提示其在不同表达水平转录本的捕获中具有一定优势。
图 4｜不同工具对转录本结构、剪接位点和表达分布的比较
亮点四：NanoncRNA-seq 显著提升 lncRNA 发现能力本研究最核心的发现之一是：
Nanopore 长读长策略显著提高了 lncRNA 的识别数量，尤其是 lincRNA。在不同方法比较中：Illumina 方法识别出 51 个 lncRNA；ONT + Pinfish 识别出 260 个 lncRNA；其中 Pinfish 识别出 201 个 lincRNA。这一结果说明，长读长测序能够更好地保留转录本结构信息，帮助发现低丰度、结构复杂或缺乏 poly(A) 尾的非编码转录本。
同时，不同分析工具鉴定得到的lncRNA，在转录本长度、表达量和功能富集结果上表现不同。
图 5｜不同方法识别 lncRNA 的数量、类型、长度和表达特征
亮点五：ONT 与 Illumina 在变异识别中互补
除了转录本结构和表达分析，本研究还比较了 ONT 与 Illumina 在 SNP 和 INDEL 识别中的表现。· ONT 检出的 SNP 数量少于 Illumina，但检出的 INDEL 数量明显多于 Illumina，这说明两种平台在变异识别中具有不同的技术偏好。除此之外，ONT 可直接将变异信息与全长转录本异构体进行关联整合，为等位基因表达、异构体特异变异挖掘和转录调控机制研究提供更多可能。
技术应用1
Cell重磅 | 抑制炎症新机制！核应激体重塑基因组，靶向NFIL3或成脓毒症克星首次在人类细胞中发现可以调控RNA聚合酶转录的长非编码RNA (Cell, 2025)
2025年5月27日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲研究组在《Cell》在线发表了有关急性炎症调控的最新研究成果：“De novo assembly of nuclear stress bodies rearranges and enhances NFIL3 to restrain acute inflammatory responses”。该研究结合Nanopore全长转录组测序（包括polyA+和rRNA去除文库）及多组学分析，首次揭示灵长类特有的核应激小体（nSBs）通过重构基因组三维结构调控炎症反应的新机制，并为脓毒血症的精准诊疗提供了新思路。贝纳基因协助完成了ONT全长转录组和全长lncRNA测序工作。
重要结论：研究表明，部分SatIII 转录本是非多聚腺苷酸化（non-polyadenylated）的（图 S1E 和 S1F）。 在应激状态下（如 SA 和 HS 处理），SatIII RNA 的总转录量可能更高。
但是因为传统的 poly(A)-RNA 测序可能遗漏了非多聚腺苷酸化的转录本。因此本研究还进行了去rRNA的纳米孔测序，能够确定两个非多聚腺苷酸化的SatIII RNA对SA和HS胁迫的响应（图S1G）。
实验分析流程：使用未经处理（UN）、SA 处理和 HS 处理的 HeLa 细胞，提取 RNA 并进行 rRNA 去除（rRNA depletion），然后进行Nanopore测序，合并reads后使用FLAIR分析获得1,261,668个转录本。将组装的转录本与SatIII 基因组序列进行重叠比对最终鉴定出7,970 个 SatIII 转录本（SA 应激：7,252 个；HS 应激：7,283 个）。
文献FigS1 (G) The workflow of long-read nanopore sequencing for rRNA-depleted (ribo-) RNAs and identification of SatIII transcript. Two replicates in untreated (UN), SA-treated, and HS-treated HeLa cells. See (A) for detailed analysis procedures.
技术应用2
颠覆认知！SCI ADV项目文章揭示海洋游仆虫30nt小RNA不是“标记清除”，而是生命暗战中的“精准守护”
2-小RNA介导的基因组DNA精确删除机制 (Science Advances, 2025)
2025年10月，进化所原生动物学团队高凤教授课题组在Science Advances（《科学进展》）杂志发表了题为“Soma-derived 30-nt small RNAs are coupled with chromosome breakage and precisely target nontransposon DNA against elimination inEuplotes vannus”（ 扇形游仆虫中母本体细胞系来源的30 nt小RNA与染色体断裂偶联并精确靶向非转座子DNA序列，使其保留在子代体细胞核中）的研究成果。贝纳基因协助完成了ONT全长lncRNA测序工作。
sRNA前体为双向转录lncRNA，起始于E-CBS位点
免疫荧光染色与lncRNA测序显示，接合早期在体细胞大核中积累大量双链RNA，其反义链转录本在12小时覆盖了绝大多数纳米染色体。研究进一步采用Nanopore全长lncRNA测序技术，去除了占多数的rRNA干扰，并能够直接获取来自正义与反义链的完整单分子lncRNA序列。分析结果显示，这些作为sRNA前体的lncRNA，转录起始位点（TSS）均位于距离端粒约17–20 bp的E-CBS（5′-TTGAA-3′） motif处。这些转录本保留内含子，且与mRNA无关，支持其作为sRNA前体。研究提出，RdRP可能参与将单链转录本转化为双链RNA，供Dcl1切割生成sRNA。
实验方式：
重要结论
兼容poly(A)+和poly(A)- RNA的全面转录组分析：开发了NanoncRNA-seq新方法，通过rRNA去除和文库构建，成功实现了对poly(A)+和poly(A)- RNA的全面覆盖。
创新ONT文库构建策略：设计了具有App和C3双端修饰的定制正向引物，结合NV接头连接和改善的酶切效率，大幅提高了文库连接的特异性和效率，减少了非特异性副产物。
结合多测序平台的比较分析：采用ONT R10.4.1长读长测序和Illumina短读测序相结合，对转录本发现、表达模式、lncRNA鉴定及功能注释进行了全面评估。
ONT测序对lncRNA的高敏感性：得益于ONT长读长测序的能力，此研究发现了更多新的lncRNA，并为其提供了更完整的结构信息及功能注释，提高了对非编码RNA多样性的解析。
关键RNA特征精准解析：实现了可变剪接事件、单核苷酸多态性（SNP）以及编码RNA和非编码RNA的综合表征，为复杂转录组调控研究提供了新工具。
多领域应用潜力：通过优化的实验流程和多层次数据分析，该方法为深入研究编码与非编码RNA特征及转录组功能提供了高效平台，为疾病研究及功能性RNA解析提供了广泛的应用前景。
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贝纳基因--多场景测序应用方案引领者
武汉贝纳科技有限公司（贝纳基因）成立于2012年，是国家高新技术企业、全球最大的Nanopore服务提供商。公司以纳米孔测序技术为核心，提供涵盖多组学研究的全方位测序解决方案与科研服务。
公司总部位于武汉，在香港设有高标准实验室，并在北京、南京、香港及美国等地设分支机构。团队核心成员曾在《自然》《科学》等顶级期刊发表成果，业务遍及全球，累计服务客户超5000家。
在技术应用方面，贝纳基因完成了全球首个大型复杂植物（菊花）基因组测序，提供超长读长测序及T2T解决方案，并率先在国内实现直接RNA测序的商业化。旗下子公司贝纳医学专注临床转化，已在病原、肿瘤与遗传领域推出诊断产品。
未来，贝纳基因将继续专注于纳米孔测序技术，坚持“测序计算提升客户价值，基因解码服务人类健康”的使命，为全球科研与临床领域提供高标准、可信赖的解决方案与检测产品。
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