科技前沿丨清华大学深圳国际研究生院李炳课题组ES&T:养猪废水中抗生素与重金属共存——谁是抗生素耐药性发展的主要推手?

第一作者：黄锦

通讯作者：李炳

通讯单位：清华大学深圳国际研究生院

一、ARGs绝对丰度与表达水平的时间动态变化

图1：抗生素抗性基因的绝对丰度和表达水平。(a) 不同处理组各采样时间点ARGs绝对丰度；(b) 不同ARG类型的表达水平（TPM）；(c) 与对照组相比绝对丰度显著增加的ARG类型（copies/g biomass）。ENR：恩诺沙星。

研究通过添加内标进行ARGs丰度绝对定量，共鉴定出21种ARG类型和426个ARG亚型。结果显示，锌单独暴露组的ARGs总绝对丰度最高，第25天时较对照组高出85.7%。恩诺沙星单独暴露组中ARGs在实验周期内未出现显著富集，表明在40 μg/L的环境相关浓度下，恩诺沙星本身的驱动能力有限。铜单独暴露组在后期（40天后）ARGs丰度显著下降，推测与铜对活性污泥的较强毒性有关。共暴露组（恩诺沙星+锌）的ARGs丰度变化趋势更接近锌单独暴露而非恩诺沙星单独暴露，提示锌在共暴露中起主导作用。宏转录组分析显示，约52.3%的ARG亚型具有转录活性，其中多重耐药基因的表达水平最高。

二、重金属对抗生素耐药基因谱结构塑造起主导作用

图2：抗生素抗性基因组成结构。(a) 基于Bray-Curtis距离的ARGs组成主坐标分析；(b-d) 共暴露组与单一暴露组之间ARGs组成距离的比较（平滑曲线显示95%置信区间）。ENR：恩诺沙星。

PCoA分析显示，各处理组的ARGs组成存在显著区别（PERMANOVA，R² = 23%，P < 0.01）。共暴露组（恩诺沙星+铜或恩诺沙星+锌）的耐药基因谱结构与相应重金属单独暴露组高度聚集，而与恩诺沙星单独暴露组明显分离。进一步以Bray-Curtis距离量化后发现：恩诺沙星+铜共暴露组与铜单独暴露组之间的距离显著小于恩诺沙星+铜共暴露组与恩诺沙星单独暴露组之间的距离（Wilcoxon检验，P < 0.05）；锌暴露组呈现相同规律。这表明，在该实验设计的共暴露条件下，重金属对耐药基因谱结构的塑造作用超过了恩诺沙星。Bliss独立模型分析进一步证实，恩诺沙星与锌暴露在富集β-内酰胺类ARGs及大环内酯类ARGs存在协同效应。

三、ARGs宿主在属水平的群落演替规律

图3：在属水平上的ARGs宿主分析。 (a) 共暴露组与单一暴露组之间ARGs宿主谱的Bray-Curtis距离比较；(b) 各处理组中主要ARGs宿主在属水平的相对丰度（≥ 1%）。ENR：恩诺沙星。

通过宏基因组分箱（Binning）获得425个中高质量MAGs（完整度≥50%，污染≤10%）。线性混合效应模型显示，锌暴露对ARG宿主相对丰度具有显著正效应（95% CI: 0.07–0.24，η² = 0.40）。在锌单独暴露及恩诺沙星+锌共暴露组中，Comamonas和Ginsengibacter在7–60天成为优势属，后期则被Agriteribacter、Alicycliphilus等替代。在铜暴露组中，Luteimonas（一种潜在病原菌）在60–120天成为主导。值得注意的是，这些富集的ARGs宿主往往同时携带ARGs和重金属抗性基因。例如，Comamonas同时携带czcC（负责锌外排）和多种ARGs；Sphingobacterium同时携带mphG、ermB、tetX3等ARGs以及铜抗性基因tcrB。这一现象揭示了重金属通过共选择机制驱动ARGs宿主相对丰度上升。此外，在共暴露条件下，ARGs宿主谱更接近重金属单独暴露组，再次印证重金属的主导作用。

四、质粒是ARGs传播的主要载体

图4:携带ARGs的质粒序列。 (a) 携带ARGs的质粒相对丰度在不同处理组中的变化；(b) 基于质粒或染色体上ARGs侧翼序列构建的系统发育树，显示不同遗传背景下的高度同源性；(c) 携带ARGs质粒的表达水平（TPM）；(d) 随机森林模型评估不同MGEs对ARGs组成结构影响的重要性。

系统鉴定了四类可移动遗传元件（MGEs）：整合子、噬菌体、ICEs和质粒。完整整合子仅携带少量ARGs（aadA、AAC(6')-IIa、blaCARR-3等），且其丰度与大部分ARG类型无显著相关性。噬菌体携带的ARGs仅限于baeR、ompC、ompK37，且宿主范围狭窄（仅Klebsiella michiganensis），表明通过噬菌体转导进行属间ARGs转移的潜力有限。在恩诺沙星+铜共暴露组中鉴定到ICE（ICEEal），其携带Cu²⁺外排ATP酶、tetR/tetD以及CRISPR相关基因。该ICE所在MAG（Sphingobacterium）在铜暴露组中显著富集，暗示该ICE可能增强宿主在铜胁迫下的适应性。

此外，本研究共鉴定1717个质粒序列，其中36个携带ARGs，主要携带β-内酰胺、大环内酯、四环素、磺胺和氨基糖苷类抗性基因。锌暴露显著提高了携带ARGs质粒的相对丰度（效应η² = 0.43，95% CI > 0）。随机森林模型显示质粒是影响ARGs组成结构的最关键变量。系统发育分析发现，多个ARGs（如aadS、smeE）在质粒和不同菌属的染色体上共存，且侧翼序列高度同源（100% nucleotide identity and coverage），意味着此类ARGs在不同菌属间的水平基因转移很有可能是由质粒介导发生。尤其在锌暴露组中，携带这些共享ARGs的质粒表达水平最高。此外，携带共享ARGs的宿主菌（如Luteimonas、Agriteribacter）在重金属胁迫下显著增殖，进一步表明质粒在ARGs跨宿主传播中发挥了关键作用。

五、宏转录组揭示恩诺沙星和重金属暴露下的微生物转录谱

图5：恩诺沙星和重金属暴露下的微生物转录谱。(a) 在门水平上具有转录活性的微生物分类；(b) 不同处理组中与生物膜形成、群体感应、分泌系统、转运蛋白和双组分系统相关的显著上调基因丰度相对比例；(c) 转录水平上微生物生理适应机制图。

宏转录组数据揭示了恩诺沙星和重金属胁迫下微生物包括抗生素耐药性在内的多种生理适应策略。首先，转运蛋白相关基因上调比例最高（占所有上调基因的30%–45%），其中efrAB、czcBC等外排泵基因在锌或铜暴露组中显著上调（log2 FC ≥ 2，p < 0.05），提示外排泵可能同时介导重金属和抗生素的共抗性。其次，IV型分泌系统（T4SS）相关基因（traC、virD、trbB、virB）在锌及恩诺沙星+锌共暴露组中上调2–3倍。生物膜形成相关基因（luxS、pelABD、pslGJ、pgaB）在含重金属的暴露组中上调2–7倍。此外，低通透性孔蛋白基因ompC上调、高通透性孔蛋白基因ompF下调，暗示细胞膜通透性降低以限制抗生素进入。宏转录组结果显示，在环境相关浓度下，恩诺沙星主要诱导细菌膜通透性改变驱动ARGs的水平基因转移，而重金属不仅触发类似响应，还可能通过促进接合转移和生物膜形成，在群落水平上推动ARGs的扩散。