NBE | 深圳湾实验室通过细胞外囊泡系统性递送全长DMD mRNA,在DMD小鼠和非人灵长类中恢复抗肌萎缩蛋白表达并显著改善肌肉功能

杜氏肌营养不良症(DMD)是由DMD基因突变导致抗肌萎缩蛋白缺失的致死性神经肌肉疾病。AAV载体无法包装全长~14 kb的DMD mRNA，只能递送截短的微抗肌萎缩蛋白，且存在免疫原性、肝毒性和重复给药限制。2026年6月11日，深圳湾实验室Andrew S. Lee团队在Nature Biomedical Engineering上发表“Skeletal-muscle-targeted non-viral delivery of full-length DMD mRNA for Duchenne muscular dystrophy”研究论文。该研究通过细胞纳米孔技术将全长DMD mRNA高效装载至细胞外囊泡(EV)，并通过筛选αVβ6整合素结合肽(t7、t9)修饰EVs实现骨骼肌靶向。在mdx小鼠中，DMD靶向EVs(DMD t-EVs)联合免疫抑制剂FK506反复静脉给药4个月，使骨骼肌中抗肌萎缩蛋白持续恢复至接近野生型水平，血清肌酸激酶显著降低，握力、跑步耐力、转棒时间等多项运动功能指标改善，且优于AAV9递送的微抗肌萎缩蛋白。在非人灵长类中，DMD t-EVs优先分布于骨骼肌，恢复抗肌萎缩蛋白表达(贡献率25-50%)，未引起肝毒性或免疫反应，而AAV组出现明显毒性。(话外，这个应该是上海思珀诺因生物科技有限公司SPOT-03临床前研究吧？？外泌体递送科研上相对已经成熟，但工业生产只是起步阶段，未来如何扩大生产等的完整工业配套是值得考虑的。尽管EV可以反复注射，但其免疫和生产成本是否患者能接受。最后dystrophin蛋白恢复得很好，但主图里免疫荧光感觉不匹配，而补充图里感觉又挺好)

主要研究结果

1，细胞纳米孔技术高效装载全长DMD mRNA至EVs并验证功能。

采用细胞纳米孔(CNP)技术将全长DMD-GFP mRNA(~12 kb)转染至新生儿人真皮成纤维细胞，收集分泌的EVs(图1a)。DMD EVs粒径~150 nm，表达CD9、CD63、Alix、Tsg101等标志物(图1b-c及扩展数据图1b-d)。CNP法的装载效率较常规电泳高约800倍，每个EV平均含5-8个DMD mRNA拷贝(图1d-e)。凝胶电泳确认EV内为完整全长DMD转录本(图1f)。从mdx小鼠分离的原代成肌细胞(CD45⁻CD31⁻Sca1⁻VCAM1⁺Pax7⁺)与DMD EVs共孵育后，抗肌萎缩蛋白表达呈剂量依赖性增加，高剂量组恢复至野生型水平(图1g-j)。

图1 基于EV的非病毒mRNA递送。

2，工程化肌肉靶向EVs(t-EVs)实现骨骼肌特异性递送。

将携带RGD基序的7-mer肽(t1、t7、t9、t11)融合至CD47的N端，并展示于EV表面(图2a及扩展数据图2a-b)。t7-和t9-EVs在C2C12细胞中的摄取效率最高(图2b及扩展数据图2d-h)。机制研究表明，t9-EVs通过αVβ6整合素介导进入细胞，主要经脂筏和巨胞饮途径内化，并有效逃逸溶酶体(扩展数据图3-4)。在裸鼠中，静脉注射DiR标记的t7-和t9-EVs后，骨骼肌(胫骨前肌、股四头肌、腓肠肌、三头肌、膈肌)荧光信号显著高于非靶向EVs和LNP，而肝脏、心脏等非靶器官信号极低(图2c-m)。t-EVs在膈肌中的高效蓄积提示其可能改善呼吸功能。

图2 肌肉靶向EVs的体外验证及体内分布。

3，DMD t-EVs在mdx小鼠中实现长期抗肌萎缩蛋白恢复和功能改善。

mdx小鼠接受DMD t-EVs(含DMD-GFP mRNA)联合FK506反复静脉注射(每周2次，持续4个月)(图3a)。血清DMD mRNA水平升高(图3b)，骨骼肌(胫骨前肌、股四头肌、腓肠肌、三头肌、膈肌)中抗肌萎缩蛋白表达随时间递增，第4个月时蛋白水平接近野生型(图3c-d及扩展数据图5)。血清肌酸激酶显著下降(图3e)。免疫荧光证实抗肌萎缩蛋白正确定位于肌膜，肌纤维形态改善(图3f及扩展数据图5d-f)。握力、转棒最长停留时间、跑步距离与时间、自主跑轮运动等指标从第2周开始持续改善至第4个月(扩展数据图6)。肝脏、肾脏组织学及血清生化指标无异常，未见免疫细胞浸润或炎症因子升高(扩展数据图7-8及补充图9-11)。

图3 静脉注射DMD t-EVs在mdx小鼠中恢复骨骼肌抗肌萎缩蛋白。

4，DMD t-EVs疗效优于AAV9-微抗肌萎缩蛋白。

将DMD t-EVs/FK506与AAV9-微抗肌萎缩蛋白-EGFP(靶向或非靶向)在mdx小鼠中进行头对头比较(图4)。DMD t-EV组在4周时的握力、转棒时间、跑步距离、自愿跑轮运动等指标均显著优于AAV组(图4a-g)。离体肌肉生理学检测显示，DMD t-EV组的单次抽搐力(sPt)和最大强直力(sPo)显著高于AAV组(图4h-i)，疲劳指数也优于AAV组(图4j-k)。免疫荧光和Western blot证实DMD t-EV组抗肌萎缩蛋白表达水平更高(图4l-n)。

图4 DMD t-EVs与AAV-微抗肌萎缩蛋白在mdx小鼠中的疗效比较。

5，DMD t-EVs在非人灵长类中安全有效。

在普通狨猴中，DMD t-EVs联合FK506反复静脉给药(每3天1次，共7次)(图5a)。t-EVs优先分布于骨骼肌(股四头肌、胫骨前肌、二头肌、腘绳肌、腓肠肌、三头肌、膈肌)，肝脏分布显著低于非靶向EVs(图5b-c及扩展数据图9a-b)。给药后第20天，Western blot和ELISA证实骨骼肌中抗肌萎缩蛋白表达显著升高，贡献率达25-50%(图5d-j及扩展数据图9c-e)。肌肉活检显示外源性抗肌萎缩蛋白持续表达超过30天(扩展数据图9f-j)。高剂量组(4.51×10^11拷贝)肌肉中抗肌萎缩蛋白增加48.9%(补充图12)。安全性评估显示，DMD t-EV治疗组血清ALT、AST、肌酐、BUN、碱性磷酸酶等指标正常，组织学未见异常，无CD3+ T细胞或巨噬细胞浸润(图5k-l及扩展数据图10a-f)。相比之下，高剂量AAV9-t-微抗肌萎缩蛋白处理引起血小板减少、ALT/AST升高、乳酸、补体C3/C4及肌钙蛋白I升高，提示肝、肾及心脏毒性(扩展数据图10g)。

图5 全身递送DMD t-EVs在非人灵长类中安全有效恢复全长抗肌萎缩蛋白。

综上所述，本研究开发了骨骼肌靶向的细胞外囊泡平台，实现了全长DMD mRNA的高效装载和系统性递送，在DMD小鼠和非人灵长类中安全、持久地恢复抗肌萎缩蛋白表达并显著改善肌肉功能，避免了AAV载体的包装容量限制、免疫原性和肝毒性等问题。然而，该研究使用FK506免疫抑制以降低对人源EV和人全长抗肌萎缩蛋白的免疫排斥，临床应用中可能需要更优化的免疫调节方案；在非人灵长类中抗肌萎缩蛋白恢复水平(25-50%)虽显著，但未达到完全正常化；心脏中抗肌萎缩蛋白恢复有限，而心肌病是DMD患者的主要死因之一，未来需优化心脏靶向；此外，EV的大规模生产和质量控制仍面临挑战，长期重复给药的安全性和有效性需进一步验证。

参考来源：

Tian, Y., Liu, Y., Tong, Y. et al. Skeletal-muscle-targeted non-viral delivery of full-length DMD mRNA for Duchenne muscular dystrophy. Nat. Biomed. Eng (2026). https://doi.org/10.1038/s41551-026-01689-5

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