深圳大学附属华南医院 | 突破宫颈癌治疗瓶颈!YTHDF3 通过 m⁶A 稳定 STAT3,抑制 ISG 通路促癌

细胞层面：采用 SiHa、CaSki、TC-1 细胞系，通过 CRISPR/Cas9 构建 YTHDF3 敲除细胞，利用 siRNA、shRNA 实现基因沉默，过表达质粒进行功能 Rescue 实验；运用 RT-qPCR 检测基因表达，Western blot 验证蛋白水平，免疫荧光观察分子定位，MeRIP-qPCR 检测 m⁶A 修饰富集，actinomycin D 和 cycloheximide 实验分析 mRNA 和蛋白稳定性；多组学分析包括 RIP-seq（鉴定 YTHDF3 结合 RNA）、Ribo-seq（分析翻译效率）、RNA-seq（筛选差异基因）。组织层面：利用包含 62 例宫颈癌和 11 例正常宫颈组织的组织芯片，通过 IHC 检测 m⁶A 和 YTHDF3 表达。动物层面：构建 Ythdf3 敲除 C57BL/6J 小鼠，建立 TC-1 细胞异种移植模型，通过 IHC、流式细胞术分析肿瘤组织中蛋白表达及免疫细胞浸润情况，ELISA 检测血清 IFN-α 水平，全面验证 YTHDF3 的体内功能。

① HPV 阳性宫颈癌组织中 m⁶A 修饰和 YTHDF3 表达显著高于 HPV 阴性组织，且二者阳性表达率及 IHC 评分均升高；② YTHDF3 敲除抑制 HPV 基因组整合及 E6 癌蛋白表达，其 RNA 结合结构域突变后 E6 表达降低；③ YTHDF3 敲除显著上调 ISG（如 IRF7）及 IFN-α/β 表达，激活抗病毒通路；④ 多组学证实 STAT3 是 YTHDF3 的靶基因，YTHDF3 通过 METTL3 介导的 m⁶A 修饰增强 STAT3 mRNA 稳定性和翻译效率；⑤ STAT3 沉默抑制 HPV 感染及 E6 表达，且可逆转 YTHDF3 敲除对 IRF7 的激活作用；⑥ Ythdf3 敲除小鼠异种移植模型中，肿瘤 HPV 载量降低，血清 IFN-α 升高，STAT3 表达降低而 IRF7 升高，同时 Treg、M2 巨噬细胞、MDSCs 等免疫抑制细胞浸润减少，CD8+T 细胞活化增强。

Figure 1：YTHDF3 促进 HPV 致癌作用

该图通过临床样本分析、细胞实验及突变体验证，明确了 YTHDF3 在 HPV 驱动宫颈癌发生中的核心作用。首先，临床组织芯片的 IHC 结果显示，HPV 阳性宫颈癌组织中 m⁶A 修饰水平和 YTHDF3 表达量显著高于 HPV 阴性组织，且二者阳性表达率和评分均明显升高，证实 YTHDF3 与 HPV 感染及宫颈癌发生存在关联。随后，CRISPR/Cas9 构建的 YTHDF3 敲除 SiHa 细胞实验中，免疫荧光显示 HPV 基因组核定位减少，qRT-PCR 和 Western blot 证实 E6 癌蛋白的转录和表达水平下降，而 E7 无显著变化，表明 YTHDF3 可促进 HPV 基因组整合并选择性调控 E6 表达。此外，YTHDF3 突变体（缺失关键 RNA 结合结构域）转染实验显示，突变体无法维持 E6 高表达，进一步证明 YTHDF3 需通过其 RNA 结合结构域发挥促癌作用，而 HPV-DsRed 报告基因实验则直接验证了 YTHDF3 缺失会抑制 HPV 感染效率和基因组整合能力。

Figure 2：YTHDF3 负向调控宫颈癌中 I 型干扰素刺激基因（ISG）的表达

该图通过多组学分析和功能验证，揭示了 YTHDF3 对 I 型 IFN 信号通路的抑制作用。RNA-seq 结合 GO 和 KEGG 分析显示，YTHDF3 敲除后，差异表达基因主要富集于病毒应答、免疫反应及 JAK-STAT 信号通路，火山图和 GSEA 进一步证实，YTHDF3 缺失会显著上调 IRF7、TLR4 等促抗病毒 ISG 的表达，同时下调 STAT3 等抑制性分子。qRT-PCR 验证显示，YTHDF3 敲除的 SiHa 和 CaSki 细胞中，IRF7、TLR3/4 等关键分子 mRNA 水平升高，STAT3 持续下调，且 IFN-α 和 IFN-β 的转录水平显著增加。功能层面，ELISA 检测证实 YTHDF3 沉默的 TC-1 细胞上清液中 IFN-α 分泌量显著提升，综合表明 YTHDF3 作为 I 型 ISG 网络的强效抑制因子，通过阻断 IFN 信号通路削弱宫颈癌的抗病毒免疫。

Figure 3：YTHDF3 依赖 METTL3 介导的 m⁶A 修饰，促进 STAT3 mRNA 稳定性和翻译效率

该图通过多组学整合和机制验证，阐明了 YTHDF3 调控 STAT3 表达的分子机制。RIP-seq、RNA-seq 和 Ribo-seq 联合分析鉴定出 STAT3 是 YTHDF3 的核心靶基因，KEGG 分析显示 YTHDF3 结合的转录本富集于 JAK-STAT 信号通路和病毒致癌通路，IGV 可视化证实 YTHDF3 直接结合 STAT3 mRNA 的 m⁶A 修饰位点，且 YTHDF3 缺失会降低 STAT3 的翻译效率。进一步实验显示，YTHDF3 敲除会同时降低 STAT3 的 mRNA 和蛋白水平，而回补 YTHDF3 可逆转该效应；METTL3 沉默（m⁶A 甲基转移酶缺失）会显著减少 STAT3 蛋白表达，MeRIP-qPCR 证实 STAT3 mRNA 存在 m⁶A 修饰富集，actinomycin D 实验表明 YTHDF3 能延长 STAT3 mRNA 半衰期，而 CHX 实验显示其对 STAT3 蛋白稳定性无影响。此外，YTHDF3 突变体实验证实，完整的 YTH 结构域是其促进 STAT3 表达的关键，且该调控具有细胞背景依赖性，最终证明 YTHDF3 通过 METTL3 介导的 m⁶A 修饰，增强 STAT3 mRNA 稳定性和翻译效率，进而抑制 IRF7/IFN-I 通路。

Figure 4：STAT3 是 YTHDF3 介导的 I 型 IFN 负向调控及 HPV 致癌中的关键分子

该图通过沉默、过表达及 Rescue 实验，明确了 STAT3 在 YTHDF3 促癌通路中的核心介导作用。首先，siRNA 沉默 STAT3 会显著降低 SiHa 细胞的 HPV DNA 水平，同时抑制 HPV E1、E2、E6 基因的转录和 E6 蛋白的表达，证实 STAT3 直接促进 HPV 基因组整合和癌蛋白表达。机制上，STAT3 沉默会显著上调 IRF7 蛋白水平，表明 STAT3 负向调控 IRF7 表达。Rescue 实验显示，在 YTHDF3 敲除或沉默的宫颈癌细胞中，过表达 STAT3 可恢复 E6 蛋白水平，并逆转 IRF7 的激活；免疫荧光实验进一步证实，STAT3 过表达能挽救 YTHDF3 缺失细胞中 HPV 颗粒的核转运效率，使其感染性接近野生型水平，综合表明 STAT3 作为 YTHDF3 的下游效应分子，通过抑制 IRF7/IFN-I 信号通路，介导 YTHDF3 促进 HPV 致癌的作用。

Figure 5：YTHDF3/m⁶A/STAT3 轴抑制抗肿瘤免疫并形成免疫抑制性肿瘤微环境（ITME）

该图通过动物模型和免疫表型分析，揭示了 YTHDF3 轴对肿瘤免疫微环境的调控作用。首先，CRISPR/Cas9 构建的 Ythdf3 敲除小鼠经 TC-1 细胞异种移植后，PCR 验证敲除效率，qPCR 证实肿瘤组织中 HPV 载量显著降低，血清 IFN-α 水平升高。IHC 检测显示，Ythdf3 敲除小鼠肿瘤组织中 YTHDF3 和 E6 蛋白表达降低，STAT3 表达减少而 IRF7 升高，证实体内 YTHDF3 轴的调控关系。免疫细胞分析显示，Ythdf3 敲除小鼠肿瘤组织中 CD8⁺ T 细胞浸润得以维持，而 Treg 细胞、M2 型巨噬细胞（CD11b⁺/F4/80⁺/CD206⁺）和髓系来源抑制细胞（MDSCs，CD11b⁺/LY-6G⁺/LY-6C⁺）的浸润显著减少，且 M2 型巨噬细胞向 M1 型表型转换，表明 YTHDF3 缺失通过激活 IFN-I 信号，减少免疫抑制细胞积累，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫。