【最新收录】1区top!广州中医药大学刘中秋&王彩艳团队发现连翘酯苷E能显著缓解脓毒症导致的肝损伤!虚拟筛选立大功

一、先证靶点：PKM2是脓毒症肝损伤

的关键分子

通过 GEO 数据库分析与动物模型验证，明确 PKM2 的核心作用：

• 临床相关性：GSE57065 数据集显示，脓毒症患者 PKM2 基因表达显著高于健康人；GSE166488 数据集证实，脓毒症小鼠肝脏中 PKM2 高表达，且富集糖酵解、HIF-1α 等通路；

• 巨噬细胞关联：脓毒症小鼠肝脏中巨噬细胞浸润显著增加，且与 PKM2 mRNA 表达呈正相关；脓毒症小鼠巨噬细胞中，TNF、NF-κB 等炎症通路基因上调，而髓系特异性 PKM2 敲除后，这些炎症通路基因显著下调，证实 PKM2 调控巨噬细胞炎症反应；

• 表型特征：脓毒症小鼠肝脏中 M1 巨噬细胞数量显著多于 M2 巨噬细胞，提示巨噬细胞 M1 极化是肝损伤的重要驱动因素。

二、筛选验证：FE 是 PKM2

四聚化的潜在激动剂

1. 高通量虚拟筛选

• 筛选策略：以 PKM2 激动剂结合位点为靶点，从 3 万余种小分子中筛选，结合对接分数、蛋白 - 配体相互作用指纹分析，筛选出 4 个候选化合物，其中 FE 对接分数最高（-12.96）；

• 分子对接特征：FE 能稳定结合 PKM2 的激动剂结合位点，通过氢键与蛋白形成相互作用，且结构多样性符合活性化合物特征。

2. FE的初步活性验证

• 低细胞毒性：在 RAW264.7 巨噬细胞中，FE 的细胞毒性显著低于其他候选化合物，安全性更优；

• 促进 PKM2 四聚化：DSS 交联实验显示，FE 能有效促进 PKM2 四聚体形成，效果优于其他候选化合物，且呈剂量依赖性；

• 调控巨噬细胞极化：FE 显著下调 LPS 诱导的 M1 标志物（CD86、TNF-α、IL-1β）的 mRNA 和蛋白表达，上调 M2 标志物（CD206、IL-10、Arg1），减少 PKM2 核定位，抑制其促炎功能；

• 细胞特异性：FE 仅在 RAW264.7 巨噬细胞中促进 PKM2 四聚化，在 LX2（肝星状细胞）、WRL68（肝细胞）中无显著效果，提示作用具有细胞特异性。

三、靶点锁定：FE 直接结合

PKM2 K311位点，促进四聚化

通过高通量虚拟筛选与多技术验证，明确 FE 的核心作用靶点：

• 靶点鉴定：从 3 万余种小分子中筛选出 FE，经 pull-down、CETSA、SPR 等实验证实，FE 与 PKM2 直接结合，结合亲和力达 277 nM；

• 关键位点：分子对接与突变体实验显示，FE 特异性结合 PKM2 的 K311 位点，该位点在多物种中高度保守；K311A 突变后，FE 无法增强 PKM2 热稳定性，也不能促进其四聚化，证实该位点是结合必需；

• 聚合形式调控：FE 剂量依赖性促进 PKM2 四聚体形成，减少二聚体比例，降低 PKM2 核定位，抑制其蛋白激酶功能。

四、代谢重编程：抑制糖酵解

恢复线粒体功能

FE通过 PKM2 四聚化重塑巨噬细胞代谢模式：

• 抑制糖酵解：FE 显著降低 LPS 诱导的巨噬细胞乳酸分泌和糖酵解关键基因（LDHA、Glut1、HK2）表达， Seahorse 分析显示胞外酸化率（ECAR）下降，基础糖酵解和补偿性糖酵解均受抑制；

• 修复线粒体功能：提升线粒体耗氧率（OCR），恢复最大呼吸能力；改善 LPS 诱导的线粒体膜电位下降和网络碎片化，恢复管状线粒体结构，增强氧化磷酸化。

五、信号通路调控：阻断 STAT3/NLRP3，抑制炎症反应

FE通过抑制 PKM2 与 STAT3 相互作用，阻断下游炎症通路：

• 抑制 STAT3 激活：LPS 诱导 PKM2 与 STAT3 结合并促进其磷酸化（p-STAT3），FE 显著减弱二者相互作用，减少 p-STAT3 的核定位；

• 下调 NLRP3 转录：转录组测序显示 FE 富集 NOD 样受体通路，显著降低 LPS 诱导的 NLRP3 基因和蛋白表达，减少炎症因子（iNOS、TNF-α、IL-1β）释放；

• 机制协同：PKM2 四聚化抑制其蛋白激酶功能，间接阻断 STAT3 磷酸化，进而抑制 NLRP3 转录，形成 “代谢重编程 - 炎症抑制” 协同效应。

六、体内外验证：显著缓解脓毒症肝损伤

1. 细胞层面

• 推动巨噬细胞极化：FE 显著下调 M1 标志物（CD86、TNF-α、IL-1β），上调 M2 标志物（CD206、IL-10、Arg1），促进 M2 表型转化；

• 特异性依赖 PKM2：在 PKM2 K311A 突变的巨噬细胞中，FE 无法发挥抗炎和极化调控作用。

2. 动物层面

• 脓毒症模型（CLP）验证：FE 高剂量（80 mg/kg）显著改善小鼠肝组织外观（从暗褐色恢复为红褐色），减轻肝细胞肿胀、核固缩等病理损伤，降低血清 ALT、AST 水平；

• 机制一致性：小鼠肝组织中，FE 显著减少 CD86+ M1 巨噬细胞浸润，增加 CD206+ M2 巨噬细胞比例，下调 NLRP3、p-STAT3 及炎症因子表达，提升 PKM2 四聚体水平；

• 突变体验证：巨噬细胞特异性过表达 PKM2 K311A 的小鼠中，FE 的肝保护作用完全消失，证实 PKM2 K311 是 FE 作用的关键靶点。

七、安全性保障：体内分布稳定

无多器官毒性

• 原型分布：LC-MS/MS 检测显示，FE 以原型形式存在于小鼠血清和肝组织中，确保靶向作用效率；

• 低毒性：高剂量 FE 处理后，小鼠肝、肾、心、胰腺等多器官无明显损伤，器官功能标志物（如尿素、肌酸激酶、淀粉酶）无显著异常，HE 染色未发现组织病理改变。